黃芪總苷防治氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的作用及其機(jī)制研究

楊 飛 鈕崢嶸 李瑞軒 徐桂萍

氯胺酮(ketamine，KTM)是常用麻醉類藥物，臨床多用于嬰幼兒麻醉[1，2]。近年來(lái)，隨著國(guó)家計(jì)劃生育政策的調(diào)整，新生兒數(shù)量不斷增加，臨床應(yīng)用氯胺酮對(duì)嬰幼兒實(shí)施檢查和手術(shù)麻醉的病例亦不斷增加。但有研究表明，氯胺酮在麻醉時(shí)可引發(fā)神經(jīng)毒性和記憶損害等不良反應(yīng)，并可引起認(rèn)知功能減退[3，4]。因此，氯胺酮對(duì)發(fā)育中大腦的神經(jīng)毒性作用越來(lái)越引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[5]。

黃芪來(lái)源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，被《中國(guó)藥典》2015年版收載，其性微溫，味甘，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效[6]。黃芪總苷是黃芪中的主要藥效成分，屬于皂苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗缺血性腦損傷、抗衰老和改善記憶等多種藥理作用[7～9]。但有關(guān)黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的防治作用及其機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究中以氯胺酮麻醉幼鼠復(fù)制記憶損傷模型，研究黃芪總苷對(duì)其治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，50只，清潔級(jí)，21日齡幼鼠，雌雄各半，體質(zhì)量50±2g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2.藥物與試劑：黃芪總苷(含量：98%，批號(hào)：EY-(USP)-0202，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所。caspase-3抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜(美國(guó)Millipoer公司)。

3.儀器：Morris水迷宮(上海基爾頓生物科技有限公司)；Nikon ECLIPSE 80i正置顯微鏡；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀(中國(guó)上海美谷分子儀器有限公司)；BT125D型萬(wàn)分之一電子天平(Sartorius公司)；Morris水迷宮及視頻分析軟件。

4.動(dòng)物分組及給藥：50只SD幼鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、氯胺酮組、氯胺酮+黃芪總苷高劑量(80mg/kg)組，氯胺酮+黃芪總苷中劑量(40mg/kg)組、氯胺酮+黃芪總苷低劑量(20mg/kg)組，每組各10只。氯胺酮組及氯胺酮+黃芪總苷組腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)，空白對(duì)照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。除正常對(duì)照組外，其余各組麻醉至翻正反射消失后，行假手術(shù)處理，無(wú)菌操作，于上腹部正中線做一長(zhǎng)約1.5cm切口，探查腹部5min，關(guān)腹，縫合傷口。術(shù)后，氯胺酮+黃芪總苷各組分別灌胃相應(yīng)劑量黃芪總苷，1次/天，連續(xù)1周，正常對(duì)照組、氯胺酮組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。

5.學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)：采用Morris水迷宮，末次給藥后，將各組動(dòng)物禁食不禁水12h，進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。將各組幼鼠放入水槽自由游泳2min，適應(yīng)迷宮內(nèi)、外環(huán)境及游泳狀態(tài)，持續(xù)訓(xùn)練3天，2次/天；第4天起，開(kāi)始定位巡航實(shí)驗(yàn)，幼鼠從4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn)分別入水，記錄其自入水到爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間(逃避潛伏期)，如果幼鼠在90s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)休息10s，逃避潛伏期記為90s。定位巡航結(jié)束后進(jìn)行1天的空間探索實(shí)驗(yàn)，撤出平臺(tái)，將幼鼠放入水中自由游泳，記錄各鼠首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間以及在90s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。采用Morris水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)的采集和處理。

6.血清SOD、MDA水平測(cè)定：學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以10%水合氯醛(3.5ml/kg)對(duì)各組幼鼠進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血5ml，室溫靜置2h，4℃下3000r/min離心5min，分離血清，迅速至-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)血清SOD活性及MDA含量。

7.腦組織病理學(xué)檢查：取血完畢后，立即斷頭取幼鼠大腦海馬組織，一部分置液氮中凍存，另一部分以4%多聚甲醛溶液固定，4℃過(guò)夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、制成4μm切片，用于蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)病理變化。

8.Western blot法檢測(cè)腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)：處死動(dòng)物后，取凍存海馬區(qū)腦組織50mg，液氮中研磨，加入組織裂解液裂解后，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加5×上樣緩沖液煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，Bcl-2、caspase-3一抗(1∶1000)稀釋液室溫孵育2h，繼以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)稀釋液室溫孵育1h，按照ECL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上，反應(yīng)1 min，最后將膜放入暗室壓片成像。結(jié)果用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J軟件對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行定量。

結(jié) 果

1.黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)影響：正常對(duì)照組幼鼠大腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞密集，數(shù)量多，橢圓形或圓形，排列整齊，神經(jīng)元胞質(zhì)豐滿，核仁明顯；氯胺酮組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核緊縮，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，提示氯胺酮麻醉可導(dǎo)致幼鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷；氯胺酮+黃芪總苷各劑量組神經(jīng)細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞核仁清晰，數(shù)量較多，提示黃芪總苷對(duì)氯胺酮導(dǎo)致幼鼠海馬區(qū)損傷的神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用(圖1)。

圖1 各組幼鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE,×400)A.正常對(duì)照組；B.氯胺酮組；C.氯胺酮+黃芪總苷高劑量組；D.氯胺酮+黃芪總苷中劑量組；E.氯胺酮+黃芪總苷低劑量組

2.黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的影響：定位巡航階段第1天和第2天，氯胺酮組、氯胺酮+黃芪總苷各劑量組的潛伏期均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，氯胺酮組與氯胺酮+黃芪總苷各劑量組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示氯胺酮麻醉可造成幼鼠記憶損傷。第3天氯胺酮+黃芪總苷各劑量組與正常對(duì)照組幼鼠逃避潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯著低于氯胺酮組(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。空間探索實(shí)驗(yàn)中，氯胺酮組首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間顯著長(zhǎng)于正常對(duì)照組，穿臺(tái)次數(shù)顯著少于正常對(duì)照組，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間顯著短于氯胺酮組(P<0.05)，穿臺(tái)次數(shù)顯著多于氯胺酮組(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

3.黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷幼鼠血清SOD、MDA水平的影響：與正常對(duì)照組比較，氯胺酮組幼鼠血清SOD活性顯著下降，MDA含量顯著提升(P<0.05)；與氯胺酮組比較，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠血清SOD活性顯著提升，MDA含量顯著降低(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表1 黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

表2 黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

表3 黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷幼鼠血清中SOD、MDA水平的影響

4.黃芪總苷對(duì)氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白水平的影響：與正常對(duì)照組比較，氯胺酮組幼鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與氯胺酮組比較，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組幼鼠腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與氯胺酮組比較,#P<0.05

討 論

全身麻醉藥的主要不良反應(yīng)表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙。越來(lái)越多的研究表明，氯胺酮可影響幼年幼鼠學(xué)習(xí)和記憶功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)，多次使用氯胺酮可損傷動(dòng)物海馬神經(jīng)元，影響其學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制與氯胺酮影響動(dòng)物腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)和乙酰膽堿(Ach)水平有關(guān)[11]。水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練對(duì)環(huán)境和平臺(tái)有空間記憶，判斷并尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn)方法，主要用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力，當(dāng)水下平臺(tái)被撤回時(shí)，通過(guò)平臺(tái)位置的插入頻率來(lái)確定動(dòng)物的記憶。該實(shí)驗(yàn)方法廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、阿爾茨海默病、智力與衰老等方面的研究，是目前公認(rèn)的用于研究學(xué)習(xí)和記憶能力的方法[12，13]。本研究通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用氯胺酮麻醉后，幼鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，提示復(fù)制氯胺酮致幼鼠記憶功能損傷模型成功。

細(xì)胞凋亡反映細(xì)胞損傷的表現(xiàn)形式之一，其形成過(guò)程涉及到多種影響因素和作用機(jī)制所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程。但無(wú)論哪種作用因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其信號(hào)通路中均存在共同的調(diào)控靶點(diǎn)。凋亡蛋白酶caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的指示劑，屬于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，其在細(xì)胞凋亡程序中起樞紐作用。Bcl-2是一種抑制凋亡基因，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2亦發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可通過(guò)與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14～16]。

氧化應(yīng)激損傷是由于機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞致使自由基在體內(nèi)發(fā)生負(fù)反應(yīng)，生成超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化亞硝基等自由基和非自由基活性產(chǎn)物，積累堆積造成機(jī)體組織細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。因此，研究記憶損傷動(dòng)物腦組織細(xì)胞凋亡時(shí)，并行研究氧化應(yīng)激損傷，有助于分析記憶損傷機(jī)制[17，18]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的氧自由基清除酶之一，可有效清除細(xì)胞內(nèi)各種自由基和非自由基活性產(chǎn)物，同時(shí)可以抑制過(guò)多的羥自由基的產(chǎn)生，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少M(fèi)DA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成[19，20]。

本研究結(jié)果顯示，黃芪總苷具有防治氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的作用。氯胺酮+黃芪總苷各劑量組的潛伏期均顯著低于氯胺酮組，首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間顯著短于氯胺酮組，穿臺(tái)次數(shù)顯著多于氯胺酮組。氯胺酮組幼鼠血清中SOD活性下調(diào)、MDA含量升高，腦組織中Bcl-2表達(dá)減少、caspase-3表達(dá)量增高。給予不同劑量的黃芪總苷治療后，該情況出現(xiàn)改善，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠血清SOD活性顯著提高，MDA表達(dá)顯著降低，腦組織Bcl-2表達(dá)顯著增加，caspase-3表達(dá)減少。此研究結(jié)果表明，黃芪總苷能在一定程度上提高氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠體內(nèi)SOD活性，并有效清除氧自由基，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化損傷能力。此外，可促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)量。上述作用機(jī)制可能僅是一方面，有關(guān)黃芪總苷防治氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷具體的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究探討。