microRNA-132通過調節VEGF通路抑制缺血性腦血管病患者血管生成的機制研究

李 巍 高 洋 趙永剛 劉 欣 孫顯輝 呂 彥 張景華

缺血性腦血管病具有高發生率、高致殘率及高病死率的特點，是指中樞神經系統局灶性缺血所致的神經功能障礙[1]。我國每年約有200萬缺血性腦血管病患者發病，其中60%左右留有不同程度的殘疾[2]。該疾病的病理特征主要表現為頸動脈壁的逐漸變化和動脈的慢性退化，使得動脈變細，導致整個動脈失去彈性。該疾病的形成是一個復雜的過程，其病因包括飲酒、血液黏滯度升高、高血壓、年齡、吸煙、血糖、高血脂等，相關的學說主要有氧化應激反應學說、感染學說、脂質浸潤學說、炎癥學說等[3，4]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的最重要的血管生成刺激因子，是在牛垂體形狀細胞體外細胞培養分離并純化的糖蛋白，能夠增強內皮細胞具有的分裂增生能力，還可以提升毛細血管通透性。其也可參與正常組織形態的維持和保證細胞排列結構的穩定，可保證細胞層的通透屏障功能[5]。中樞神經細胞、神經細胞可在一些內源性因子的刺激下合成、分泌VEGF，特別是中樞神經系統受到侵犯后，機體的炎性反應與免疫反應也可誘導VEGF水平升高[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類新型基因調控分子，與缺血性腦血管病的發生、發展密切相關。miRNA可影響血管內皮細胞的功能，參與血管平滑肌細胞的遷移和增殖。miRNA-132是激活突觸活性和可塑性的分子，在缺血性腦血管病患者中呈現低表達狀況[7]。miRNA-132表達下降可使得內皮細胞增殖及遷移能力均受到抑制，進而導致血管出血、破裂，誘發心腦血管疾病的發生[8]。本研究具體探討了microRNA-132通過調節VEGF通路抑制缺血性腦血管病患者血管生成的機制，從而揭示miRNA-132在缺血性腦血管病中的分子作用機制，現報道如下。

材料與方法

1.材料與試劑:人臍靜脈內皮細胞來源于中國醫學科學院的細胞儲藏中心，培養基為含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，培養條件為37℃、5% CO2；miRNA-132模擬物(5′-UAACAGUCUACAGCCAUGGUCGACCAUGGCUGUAGACUGUUAUU-3′)和miRNA-132對照模擬物(5′-CGACCAUGGCUGUAGACUGUUA-3′)購自美國Ambion 公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、轉染試劑脂質體Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人HIF-1α、VEGF單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；總RNA抽提試劑盒、Total RNA Kit 購自美國Omega公司。

2.細胞分組與轉染：人臍靜脈內皮細胞維持對數生長，轉染前1天將處于對數生長期的細胞分別接種至6孔板中，將其分為空白組、陰性組與實驗組，每組設3個重復。待細胞匯合度達60%左右時，空白組不進行轉染。陰性組與實驗組經Lipofectamine2000轉染對照模擬物及miRNA-132模擬物，轉染后6h換液。

3.MTT法檢測細胞增殖：細胞轉染后24h與36h，接種到96孔板中，根據合適的鋪板細胞數，每孔約100μl細胞懸液，培養2h，加入10μl MTT試劑，再培養4h后測定每孔的450nm吸光度，參比波長600～650nm，計算細胞增殖指數。

4.流式細胞術檢測細胞凋亡：細胞轉染后24h與36h，接種到6孔板，細胞貼壁后用PBS洗滌2 次，加入100μl Binding buffer 和FITC標記的Annexin-V(20μg/ml)10μl，室溫避光30min，再加入PI(50μg/ml)5μl，避光反應5min后，加入400μl Binding buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測，記錄細胞凋亡指數。

5.real-time PCR檢測RNA表達:本研究的miRNA-132及U6特異性擴增引物來源于ABI相關試劑盒，根據Genebank查到人HIF-1α、VEGF的mRNA序列。細胞轉染后24h與36h收集細胞，提取總RNA，采用兩步法real-time PCR：預變性95℃，15s；變性95℃、5s，退火延伸60℃、30s，共進行45個循環，數值分析采用2-△△CT分析法。

6.Western blot法檢測蛋白表達：細胞轉染后24h與36h收集細胞，裂解并提取細胞總蛋白，以BCA法檢測蛋白濃度，每孔上樣20μg蛋白，進行SDS-PAGE膠分離，轉膜后封閉過夜，用TBST溶液先快速洗滌3次，孵育一抗過夜；TBST溶液洗滌3次，孵育二抗室溫1h；TBST溶液洗滌3次，將ECL 試劑盒中A 液和B 液按1∶1 體積比例混合于EP管中，均勻覆蓋于膜的表面，避光室溫放置2min，然后進行曝光分析。

結 果

1.RNA表達比較:轉染后24h與36h，實驗組的miRNA-132表達水平顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，HIF-1α、VEGF RNA表達水平顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.細胞增殖指數比較：轉染后24h與36h，實驗組的細胞增殖指數都顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

3.細胞凋亡指數比較：轉染后24h與36h，實驗組的細胞凋亡指數都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。

表1 3組轉染后不同時間點的RNA表達比較

表2 3組轉染后不同時間點的細胞增殖指數比較

表3 3組轉染后不同時間點的細胞凋亡指數比較

4.HIF-1α、VEGF蛋白表達比較：轉染后24h與36h，實驗組的HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量顯著低于陰性組與對照組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1。

圖1 3組細胞 HIF-1α、VEGF蛋白表達比較A. 24h; B. 36h

討 論

缺血性腦血管病在臨床上比較常見，該疾病的發生機制尚不十分明確，涉及到血流動力學改變、微血栓等學說[9]。現代研究顯示缺血性腦血管病的病因是血液系統與腦組織之間的直接屏障——腦血管內皮細胞被嚴重損傷，特別是損傷引起白細胞和內皮細胞持續性釋放可溶性黏附分子以及各種細胞因子，促使單核細胞黏附于血管內皮細胞，轉變為巨噬細胞，導致疾病的發生與惡化[10]。

VEGF廣泛存在于機體內，主要在血管內皮細胞中表達[11]。VEGF能促進血管內皮細胞增殖，參與血管的生成，增加血管的通透性，在缺血性腦損傷時具有一定的腦保護作用[12]。低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是哺乳動物和人體內的核轉錄因子，HIF-1α在腫瘤細胞中可獲得大量表達，可以激活PI3K/AKT/FRAP途徑，從而調節細胞增殖與凋亡[13]。miRNA-132在慢性角膜炎組織中高表達，通過作用于VEGF，參與病毒感染恢復期血管修復過程，anti-miRNA-132可以減少角膜血管新生，降低角膜炎損傷[14]。本研究轉染后24h與36h，實驗組的miRNA-132表達水平顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，HIF-1α、VEGF RNA與蛋白表達水平顯著低于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較,差異無統計學意義(P>0.05)，表明過表達miRNA-132能夠抑制HIF-1α、VEGF的表達。當前也有研究顯示miR-132通過調控SIRT1信號突進，抑制有利于細胞修復的脂類物質的合成，促進血管內皮細胞的炎癥過程，抵制血管內皮細胞增殖、遷移的修復過程，從而使內皮細胞活性減低[15]。

現代研究表明,miRNA與疾病發生和發展關系密切，特異的miRNA表達譜可作為疾病預防和診斷的標志物[16～18]。miRNA-126通過加強內皮細胞的修復，發揮了抗動脈粥樣硬化的作用，也可能通過直接抑制VEGF通路的負性調節因子來調節內皮細胞對VEGF的應答，從而促進冠狀動脈粥樣硬化[19,20]。HIF-1由α亞單位和β亞單位組成，α亞單位受氧調控，具有特異性，對HIF-1活性有著決定性作用。本研究顯示轉染后24h與36h，實驗組的細胞凋亡指數都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，細胞增殖指數都顯著高于陰性組與空白組(P<0.05)，陰性組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明過表達miR-132能抑制內皮細胞的增殖與促進其凋亡。在未來的深入研究中，還需通過驗證miRNA-132下游靶基因，繼續闡明miRNA-132參與人臍靜脈內皮細胞增殖與凋亡的分子機制，為開發新的缺血性腦血管病治療手段和方法提供重要的理論基礎和實驗依據。

綜上所述，miRNA-132可通過抑制HIF-1α、VEGF的表達，抑制人臍靜脈內皮細胞增殖，促進其凋亡，從而發揮抑制缺血性腦血管病患者血管生成的作用。