異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌的篩選和生物被膜形成能力的研究

王 兵 楊靖嫻 邵冬華 梁國(guó)威

MRSA作為醫(yī)院感染的常見(jiàn)病原菌之一，目前治療主要依賴于糖肽類抗生素。隨著萬(wàn)古霉素臨床使用的增多，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌(VISA)及異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌(hVISA)，成為醫(yī)學(xué)治療的難題。目前認(rèn)為hVISA作為VISA的前體，母代對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，MIC≤2mg/L，但是子代中卻存在少量可以在萬(wàn)古霉素含量≥4mg/L的BHI平皿上生長(zhǎng)的亞群，發(fā)生率為10-6～10-5，在治療過(guò)程中，隨著不斷存在的萬(wàn)古霉素的選擇壓力，導(dǎo)致hVISA克隆的增加，并逐漸發(fā)展為VISA，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥[1]。目前在臨床上還沒(méi)有一種簡(jiǎn)單方便并且敏感度和特異性都比較高的方法用于hVISA篩選,這也成為困擾臨床和實(shí)驗(yàn)室工作的難題。本研究以改良菌群分析策略-曲線下面積(PAP-AUC)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)替考拉寧腦心浸液瓊脂平皿篩選方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，了解筆者醫(yī)院hVISA的發(fā)生率，探索出適合筆者醫(yī)院檢驗(yàn)科hVISA的篩選方法和平臺(tái)，以便盡早發(fā)現(xiàn)并向臨床報(bào)道hVISA，引起臨床的重視[2]。同時(shí)，筆者也探索了hVISA菌株的生物被膜形成能力以及生物被膜中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感度，篩選出對(duì)其敏感的抗生素，期待對(duì)臨床有提示作用，盡早采取措施，避免VISA和VRSA的發(fā)生。

材料與方法

1.菌株來(lái)源：收集航天中心醫(yī)院2014～2017年臨床分離的139株MRSA菌株，其中痰標(biāo)本59株，血標(biāo)本37株，鼻拭子19株，分泌物9株，其他15株，所有菌株均經(jīng)過(guò)VITEK2-Compact儀器鑒定,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700698(Mu3)購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心。

2.試劑和材料：VITEK全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和比濁儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，萬(wàn)古霉素和替考拉寧粉劑購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar, BHIA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth, TSB)購(gòu)自英國(guó)OXCID公司，剛果紅干粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

3.hVISA篩選：(1)替考拉寧瓊脂平皿篩選法：挑取哥倫比亞血平板上培養(yǎng)過(guò)夜的MRSA單個(gè)菌落，用0.85%的NaCl溶液配置成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，吸?0μl菌液點(diǎn)種在含有替考拉寧5mg/L的BHIA(BHIA5T)上，35℃培養(yǎng)48h，平板上有≥1個(gè)菌落為hVISA陽(yáng)性，每個(gè)菌株重復(fù)兩次。以ATCC25923為陰性對(duì)照，Mu3為陽(yáng)性對(duì)照。(2)改良菌群分析策略-曲線下面積法(PAP-AUC)：制備不同濃度的萬(wàn)古霉素腦心浸液瓊脂平板：每400ml BHI中分別加入10mg/ml的萬(wàn)古霉素母液0、20、40、80、100、160、240、320μl，配置成濃度為0、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、6.0、8.0mg/L 8個(gè)濃度的BHI平皿。在8ml的TSB中加入培養(yǎng)過(guò)夜的純菌落，35℃振蕩培養(yǎng)24h后形成的菌液定義為原液。將原液用0.85%的NaCl溶液稀釋成105CFU/ml和102CFU/ml兩種濃度，然后取原液和稀釋菌液50μl分別均勻涂布到上述7個(gè)含萬(wàn)古霉素的濃度的BHIA上，充分晾干后在35℃溫箱培養(yǎng)48h，以Mu3為陽(yáng)性對(duì)照，ATCC29213為陰性對(duì)照。利用Graphpad Prism軟件繪制菌落數(shù)lg對(duì)數(shù)值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度的曲線并計(jì)算曲線下面積AUC，比較待測(cè)菌株的AUC與Mu3的AUC。目前公認(rèn)的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為(AUC待測(cè)菌株/AUCMu3)<0.9為萬(wàn)古霉素敏感的金黃色葡萄球菌(VSSA)；(AUC待測(cè)菌株/AUCMu3)≥1.3為VISA；0.9≤(AUC待測(cè)菌株/AUCMu3)<1.3為hVISA。

4.生物被膜形成能力檢測(cè)：(1)剛果紅瓊脂實(shí)驗(yàn)：將凍存菌株接種于哥倫比亞血平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于剛果紅平板上，37℃培養(yǎng)24h后于室溫放置24h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。如果出現(xiàn)黑色干燥菌落則提示為生物膜陽(yáng)性菌株，紅色光滑菌落則提示為生物膜陰性菌株。(2)半定量黏附檢測(cè)：采用96孔板培養(yǎng)、結(jié)晶紫染色法進(jìn)行半定量檢測(cè)。挑取在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)24h的單個(gè)菌落，加入8ml的TSB培養(yǎng)液，搖菌過(guò)夜；取過(guò)夜的菌液用TSB配成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?6孔板中每孔200μl，每個(gè)重復(fù)3孔，37℃培養(yǎng)24h； 吸取96孔板中的液體，用200μlPBS洗3次，棄去液體； 每孔加入200μl的無(wú)水乙醇固定15min，倒掉液體，自然晾干； 每孔加入0.5%的結(jié)晶紫200μl，染色2min，PBS洗3次，加入100μl無(wú)水乙醇室溫放置10min，595nm處測(cè)吸光度值(A值)。按照Christensen等1985年提出的生物被膜黏附程度的分類方法，將生物被膜分為不黏附、弱黏附、中等黏附和強(qiáng)黏附4種，采用微孔板法測(cè)定生物被膜的臨界A值(AC),AC等于空白對(duì)照的A均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差，因此可以根據(jù)以下A范圍進(jìn)行生物被膜分類：A≤AC為不黏附，AC4AC為強(qiáng)黏附[3]。隨后，筆者檢測(cè)了低濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)生物被膜形成能力的影響，即在配置菌液的時(shí)候加入不同濃度的萬(wàn)古霉素(0、0.5、1.0mg/L)，其他步驟同上。

5.最低抑菌濃度(minimium inhibition concentration, MIC)和最低抑制生物被膜濃度(minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC)測(cè)定：采用2015年版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC。然后，體外制備生物被膜模型，用TSB將萬(wàn)古霉素做梯度稀釋，濃度范圍為1×MIC～1024×MIC。取200μl加入96孔板生物被膜模型中，無(wú)菌TSB作為陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)24h，將肉眼觀察無(wú)渾濁孔的最低藥物濃度即MBIC。

結(jié) 果

1.替考拉寧瓊脂平皿篩選:139株MRSA經(jīng)過(guò)BHIA5T初篩陽(yáng)性46株。S131、S134和S92菌株在平皿上有菌落生長(zhǎng)，為BHIA5T初篩陽(yáng)性菌株，Mu3為陽(yáng)性對(duì)照，ATCC25923為陰性對(duì)照，詳見(jiàn)圖1。

圖1 BHIA5T篩選結(jié)果

2.hVISA的臨床分離率：139株MRSA經(jīng)過(guò)PAP-AUC方法檢測(cè)，確定hVISA陽(yáng)性菌株僅1株，為S92,來(lái)源于血標(biāo)本，因此血標(biāo)本中hVISA的分離率為2.7%，筆者醫(yī)院臨床上hVISA的總體分離率為0.72%。這例患者的萬(wàn)古霉素MIC的濃度為2μg/ml，之前的研究結(jié)果也顯示hVISA菌株的萬(wàn)古霉素的MIC一般集中在1～2μg/ml。PAP-AUC結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌群分析/曲線下面積(PAP-AUC)圖ATCC700698(Mu3)作為陽(yáng)性質(zhì)控菌株，ATCC29213作為陰性質(zhì)控菌株，AUCS92/AUCMu3=1.21，因此S92為hVISA菌株

3.hVISA的生物被膜形成能力：經(jīng)過(guò)剛果紅瓊脂實(shí)驗(yàn)，S92菌株菌落明顯變黑，顯示有生物被膜形成(圖3)，隨后進(jìn)行96孔板的培養(yǎng)和結(jié)晶紫染色，發(fā)現(xiàn)96孔板的底部有明顯的生物膜形成，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)，A值(1.00±0.05)明顯高于萬(wàn)古霉素敏感的29213菌株(0.39±0.05)，空白對(duì)照的Ac為0.14，因此，依據(jù)A值范圍對(duì)生物被膜進(jìn)行分類，S92屬于強(qiáng)黏附的生物被膜菌株。

圖3 剛果紅瓊脂實(shí)驗(yàn)A.菌落呈現(xiàn)紅色，無(wú)生物被膜形成；B.菌落呈現(xiàn)黑色，生物被膜形成陽(yáng)性

4.低濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)生物被膜的影響：在研究中筆者將培養(yǎng)S92菌株的96孔板中加入了1/4MIC即0.5mg/L的萬(wàn)古霉素，發(fā)現(xiàn)此菌株形成生物被膜能力增強(qiáng)了，A值為1.26±0.22，但是萬(wàn)古霉素濃度增加為1mg/L時(shí)，形成的生物被膜減弱了，A值為0.57±0.12(圖4)。

圖4 低濃度萬(wàn)古霉素對(duì)生物被膜的影響

5．生物被膜中細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感度降低：通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)S92菌株的最低抑制生物被膜濃度(MBIC)明顯升高，256μg/ml的萬(wàn)古霉素濃度才能完全抑制生物被膜的生長(zhǎng)，生物被膜中的細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感度降低，MIC值升高。

討 論

自萬(wàn)古霉素1958年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于MRSA引起的感染，一直以來(lái)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌保持著較高的活性，但是自1997年日本首次報(bào)道hVISA以來(lái)，多個(gè)國(guó)家也陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了hVISA和VISA[4～7]。hVISA存在于VISA前期，雖然hVISA的母代對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，但是在萬(wàn)古霉素的選擇壓力下，hVISA克隆增加，最終形成VISA，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥，并且hVISA存在不同的表型和生物學(xué)變化，導(dǎo)致在臨床工作中難以辨認(rèn)，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，因此盡早篩選出hVISA菌株并向臨床報(bào)道就至關(guān)重要[8]。目前hVISA的檢測(cè)方法很多，作為金標(biāo)準(zhǔn)的PAP-AUC方法需要螺旋涂布儀和標(biāo)準(zhǔn)菌株Mu3，耗時(shí)費(fèi)力，無(wú)法在臨床常規(guī)工作中開(kāi)展。這幾年推薦的宏量E試驗(yàn)法，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，也有較高的敏感度和特異性，但是需要萬(wàn)古霉素和替考拉寧的E-test條，價(jià)格昂貴，也難以在臨床工作中推廣。Wang等[9]報(bào)道顯示可以用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)進(jìn)行hVISA檢測(cè)，但篩選效果有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。目前應(yīng)用較多的篩選方法仍然為含萬(wàn)古霉素或者替考拉寧的腦心浸液瓊脂平皿篩選法，本研究選用敏感度較高的BHIA5T進(jìn)行初篩，初篩陽(yáng)性的菌株再經(jīng)過(guò)PAP-AUC檢測(cè)。

不同國(guó)家和地區(qū)的hVISA分離率差異很大。Chung等[10～13]報(bào)道亞洲地區(qū)hVISA分離率為3.5%，美國(guó)為5.9%，2007年我國(guó)14個(gè)城市hVISA的檢出率為9.5%，最新報(bào)道的山東省檢出率為5.6%。本研究收集了筆者醫(yī)院的139例菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了1例來(lái)源于血標(biāo)本的hVISA，分離率為0.72%。相對(duì)于其他醫(yī)院的報(bào)道，目前筆者醫(yī)院hVISA的發(fā)生率是比較低的，分析原因有兩點(diǎn)：(1)本研究是一個(gè)單中心的研究，納入的MRSA菌株相對(duì)較少，人群?jiǎn)我弧?2)本研究納入的是患者初次入院分離凍存的菌株，沒(méi)有經(jīng)過(guò)抗生素的選擇壓力，耐藥性相對(duì)較弱。

目前筆者對(duì)hVISA的耐藥機(jī)制并不是非常了解，比較肯定的是hVISA菌株的細(xì)胞壁增厚，增厚的細(xì)胞壁交聯(lián)會(huì)明顯減少，使游離的D-丙氨酰-D-丙氨酰側(cè)鏈含量增加，這些游離的側(cè)鏈可以與萬(wàn)古霉素結(jié)合，導(dǎo)致萬(wàn)古霉素被固定在細(xì)胞壁中，無(wú)法到達(dá)作用的靶點(diǎn)。Gregorio等[14]通過(guò)自溶實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與萬(wàn)古霉素敏感的金黃色葡萄球菌比較，hVISA/VISA菌株的自溶活性明顯降低[15]。另外，近期的研究提示hVISA的耐藥可能與生物被膜形成相關(guān)，但是對(duì)于hVISA菌株的生物被膜形成能力卻存在爭(zhēng)議。Xu等[15]卻報(bào)道了hVISA菌株的生物被膜形成能力降低，而Szymanek-Majchrzak等[16]發(fā)現(xiàn)對(duì)糖肽類抗生素不敏感的MRSA菌株生物被膜形成明顯增強(qiáng)。Kaplan[17]報(bào)道了低濃度的抗生素可以促進(jìn)生物膜的形成。Abdelhady等[18]報(bào)道了對(duì)萬(wàn)古霉素治療無(wú)效的5株MRSA菌株中有4株在低濃度的萬(wàn)古霉素存在時(shí)，生物被膜形成能力明顯增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)的S92也是一個(gè)強(qiáng)黏附的生物被膜菌株，并且在加入低濃度的萬(wàn)古霉素后，S92的生物被膜形成能力增強(qiáng)，顯示低濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)生物被膜有促進(jìn)作用[17,18]。Chang等[19]研究也證明萬(wàn)古霉素在體外可以誘導(dǎo)hVISA菌株的耐藥性增強(qiáng)，并且在誘導(dǎo)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)與生物被膜黏附、聚集和增殖階段相關(guān)的多個(gè)基因如fnbA、atlA、icaA等的mRNA量增加，細(xì)菌的生物被膜形成能力逐漸增加。同時(shí)，筆者觀察到hVISA菌株形成生物被膜后，需要明顯提高萬(wàn)古霉素濃度才能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。通過(guò)K-B法檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)hVISA菌株對(duì)利奈唑胺和替加環(huán)素依然敏感，這與之前的報(bào)道也是一致的[20]。這提示在臨床上懷疑有hVISA存在，并且萬(wàn)古霉素治療時(shí)間長(zhǎng)，不排除有生物膜形成時(shí)，可嘗試換用利奈唑胺和替加環(huán)素進(jìn)行治療。

由于本研究只發(fā)現(xiàn)了1株hVISA，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和分子檢測(cè)，后續(xù)希望能夠擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究，在分子層面探索hVISA的耐藥機(jī)制以及生物被膜形成能力，為臨床治療提供更加可靠的依據(jù)。

本研究是首次檢測(cè)創(chuàng)建筆者醫(yī)院hVISA的檢測(cè)平臺(tái)，并發(fā)現(xiàn)了1株hVISA，它的生物被膜形成能力強(qiáng)，并且低濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)生物膜的形成有促進(jìn)作用，這需要引起臨床的高度重視，合理使用抗生素尤其是糖肽類藥物，也可嘗試換用利奈唑胺或替加環(huán)素，以避免VISA和VRSA產(chǎn)生，感染控制不佳，臨床治療失敗。