線粒體自噬在糖尿病因素影響七氟醚后處理心肌保護作用中的機制

郭大鵬 賀建東 韓沖芳 王一珍 王志豪 王 慧

缺血性心血管疾病已成為威脅人類健康的重要殺手，目前主要的治療措施是恢復缺血心肌的有效灌注。然而缺血心肌在恢復血液灌注后其缺血性損傷可能進一步加重，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。而七氟醚作為臨床中常用的吸入麻醉藥，被證實具有減輕非糖尿病大鼠MIRI的保護作用[2]。線粒體自噬是指細胞通過自噬的機制選擇性地清除線粒體的過程，維持適度的線粒體自噬水平對細胞內線粒體穩態及正常生理功能具有重要作用[3]。研究發現，七氟醚后處理減輕大鼠MIRI的機制與線粒體自噬關系密切[4]。糖尿病作為心血管疾病的獨立危險因素，嚴重威脅著人類的生命健康，并且糖尿病患者發生MIRI較非糖尿病患者更為嚴重[5]。研究發現，糖尿病因素可降低或取消七氟醚后處理的心肌保護作用，其機制尚有待于深入研究[6,7]。本研究擬通過建立糖尿病模型和心肌缺血再灌注模型，從線粒體自噬角度探討糖尿病因素影響七氟醚后處理心肌保護作用的機制。

材料與方法

1.動物的選擇及分組：清潔級健康雄性SD大鼠32只，7～8周齡，體質量250～300g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動物飼養和實驗操作均符合山西醫科大學動物倫理學委員會相關規定，適應性觀察1周。以是否糖尿病與是否給予七氟醚后處理進行兩因素(2×2)析因設計，采用數字表法隨機分為4組(n=8),即非糖尿病缺血再灌注組(NI/R組)、非糖尿病七氟醚后處理組(NSP組)、糖尿病缺血再灌注組(DMI/R組)和糖尿病七氟醚后處理組(DMSP組)。

2.糖尿病大鼠模型的建立：參照參考文獻[8]的方法制備大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖飼料適應性喂養4周后，禁食不禁飲8h，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，批號：S1030，美國Sigma公司)30mg/kg，72h后尾靜脈采血，測定空腹血糖。以血糖≥16.7mmol/L，并出現多飲、多食、多尿癥狀為模型制備成功。

3.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立：參照參考文獻[2]介紹的方法，采用結扎左冠狀動脈前降支血流30min再灌注120min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。SD大鼠術前禁食8h，不禁飲。經1%戊巴比妥鈉(75mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥位固定，連接肢體導聯心電圖電極，接BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)監測標準Ⅱ導聯心電圖。頸部正中切開，于氣管插管成功后連接ALC-V8型動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)行機械通氣，潮氣量8ml/kg，通氣頻率60次/分，吸呼比1∶2，呼吸機進氣口連接七氟醚揮發罐(德國Draeger公司)，呼吸機出氣口連接Vamos麻醉氣體監測儀(德國Draeger公司)，吸入氧濃度33%(氧流量3L/min)。于左側第4、5肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟及左心耳。以8-0帶線縫合針于動脈圓錐靠近左心耳下緣水平處(冠狀動脈左前降支根部1～2mm)進針穿線；穿線后將絲線兩頭穿過硅膠管，平衡15min后用血管鉗向前收緊硅膠管造成左冠狀動脈前降支缺血，以心電圖示ST段抬高、T波高聳、心肌組織顏色逐漸變暗為缺血成功標志。缺血30min時松開結扎線恢復灌注，以心電圖示ST段明顯下降，心肌缺血區恢復紅潤為再灌注成功的標志。其中NSP組和DMSP組于再灌注前1min吸入七氟醚(批號：18101931，上海恒瑞醫藥有限公司)，維持呼氣末濃度2.5%，持續5min。

4.血清cTnI濃度測定：于再灌注120min時，經頸動脈采血3ml，4℃冰箱靜置30min后，以3500r/min離心10min，離心半徑15cm，取血清置于-20℃冰箱保存。采用ELISA法檢測cTnI濃度，試劑盒購自武漢博士德生物技術公司。

5.TTC法測定心肌梗死面積：于再灌注120min時，再次收緊套管阻斷冠脈血流，頸靜脈注射1%伊文藍染液2ml后處死大鼠，快速取出心臟，于-20℃冰箱放置2h，用心臟切割器沿心臟長軸方向將其切成厚度約為2mm的薄片，行TTC染色，恒溫水浴鍋孵育15min，PBS緩沖液3次后10%甲醛固定24h。拍照后采用Image ProPlus5.0軟件進行分析，測定梗死區面積(即灰白色區域)與存活區面積(即磚紅色區域)，計算心肌梗死面積=梗死區面積/存活區面積。

6.心肌超微結構透射電鏡下觀察：于再灌注結束時處死大鼠并取心肌組織，切取約1mm3左心室組織置于2.5%戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸緩沖液配制，pH值7.4)中，4℃固定2h，經0.1mol/L 磷酸緩沖液漂洗后，用1%鋨酸固定液(0.1mol/L 磷酸緩沖液配制，pH值7.4)，4℃固定2h，組織塊經遞增濃度的乙醇脫水后用Spurr 樹脂浸透包埋，70℃聚合8h，超薄切片機切片，切片經醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，采用JEM-1011型透射電子顯微鏡觀察左心室心肌細胞超微結構及線粒體自噬的情況。

7.Western blot法檢測心肌線粒體自噬蛋白表達：取心尖組織，使用4℃預冷的PBS清洗組織兩次，去除組織中殘留血液；研磨、裂解提取組織蛋白，使用BCA蛋白質檢測試劑(批號：23225，美國Thermo Scientific公司)采用BCA法進行蛋白質濃度的測定。蛋白樣品上樣30μg，電泳分離蛋白樣品，轉移至PVED膜，室溫封閉2h，然后加入一抗LC3(1∶800，美國Cell Signaling公司)、p62(1∶1000，美國Cell Signaling公司)和Parkin(1∶800，美國Abcam公司)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次后二抗GAPDH室溫孵育2h，TBST再洗滌3次，使用ECL試劑盒(批號：1705060, 美國BIO-RAD公司)避光反應3～5min，化學光敏模式曝光顯影，采用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達水平差異。

結 果

1.心肌組織超微結構改變：電子顯微鏡下，NI/R組線粒體大小不均，排列紊亂，線粒體嵴出現斷裂，基質紊亂，線粒體出現腫脹，可見線粒體自噬體，心肌細胞損傷嚴重；與NI/R組比較，NSP組線粒體結構較完整，線粒體輕度腫脹，損傷較輕；而與NI/R組比較，DMI/R組和DMSP組線粒體損傷明顯加重，排列極紊亂，線粒體嵴出現斷裂，基質紊亂，線粒體腫脹更加明顯，空泡化、片段化變形嚴重，心肌細胞損傷更嚴重，詳見圖1。

圖1 4組大鼠心肌組織電鏡結果(透射電鏡，×20000)

2.析因方差結果：非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠發生心肌缺血再灌注時血清cTnI濃度比較差異有統計學意義(F=105.908，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組血清cTnI濃度比較差異有統計學意義(F=35.755，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在血清cTnI濃度存在交互效應(F=4.716，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠心肌梗死面積比較差異有統計學意義(F=237.070，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組心肌梗死面積比較差異有統計學意義(F=21.291，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者對心肌梗死面積存在交互效應(F=3.191，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠LC3比值比較差異有統計學意義(F=461.409，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組LC3比值比較差異有統計學意義(F=9.860，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理兩因素在LC3比值上存在交互效應(F=30.195，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠p62含量比較差異有統計學意義(F=173.962，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組p62含量比較差異有統計學意義(F=8.281，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在p62含量上存在交互效應(F=54.083，P<0.05)。非糖尿病大鼠與糖尿病大鼠Parkin含量比較差異有統計學意義(F=144.244，P<0.05)，非七氟醚后處理組與七氟醚后處理組Parkin含量比較差異有統計學意義(F=10.919，P<0.05)，糖尿病大鼠與七氟醚后處理二者在Parkin含量存在交互效應(F=25.844，P<0.05，表1，圖2)。

表1 析因試驗結果的方差分析表

圖2 析因試驗結果的交互作用圖A.cTnI;B.心機梗死；C.LC3;D.p62;E.Parkin

3.4組大鼠各指標的比較：與NI/R組比較，NSP組血清cTnI濃度降低，心肌梗死面積減少，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達下調，p62的表達上調(P<0.05)。與NI/R組比較，DMI/R組血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達下調，p62的表達上調(P<0.05)。與NSP組比較，DMSP組血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表達下調，p62的表達上調(P<0.05)。與DMI/R組比較，DMSP組血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Parkin和p62的表達差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 4組大鼠血清cTnI、心肌梗死面積及各蛋白表達比較

討 論

本研究參照參考文獻[8]的方法，以高脂高糖飼養和腹腔小劑量注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠2型糖尿病模型，并以給藥后72h的空腹血糖≥16.7mmol/L，出現多飲多食多尿癥狀為糖尿病模型制備成功。參照參考文獻[2]介紹的方法，采用結扎左冠狀動脈前降支血流30min再灌注120min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，心電圖中ST段與T波的陽性表現及心肌病理學損傷加重，表明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。

線粒體是真核生物進行能量代謝的重要場所，并且參與細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程[9,10]。通過線粒體自噬清除受損或不需要的線粒體，對于維持線粒體的穩態及細胞生存具有重要意義。線粒體自噬的調控有多條信號通路的參與，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是目前哺乳動物細胞中研究較深入的信號通路。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于線粒體外膜。Parkin是一種E3泛素酶，主要存在于細胞質中。線粒體功能正常時，PINK1通過線粒體膜上的轉位酶轉移到線粒體內膜降解。當線粒體受損時，PINK1轉運受阻，聚集于線粒體外膜。PINK1在線粒體外膜的積聚將誘導具有E3泛素連接酶活性的Parkin由胞質移位到損傷的線粒體，使線粒體外膜的特異性底物蛋白泛素化并募集p62蛋白，進而與自噬蛋白LC3結合，胞質型LC3(即LC3Ⅰ)被脂質化為膜型LC3(即LC3Ⅱ)，介導泛素化的底物進入自噬體，啟動線粒體自噬以清除受損線粒體[11,12]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低[13]。P62在細胞質中與LC3Ⅱ形成復合物，發生自噬時被溶酶體降解，表達水平降低，與自噬水平呈負相關[14]。析因試驗結果的方差分析顯示，七氟醚后處理在大鼠血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表達都存在主效應，通過七氟醚后處理，大鼠血清cTnI濃度降低，心肌梗死面積減少，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表達減少，p62表達增多，提示線粒體自噬水平降低，心肌缺血再灌注損傷減輕，七氟醚后處理的心肌保護作用可能與抑制過度激活的線粒體自噬有關。

糖尿病心血管系統損傷是糖尿病患者的主要并發癥之一[15]。本研究結果顯示，糖尿病因素在大鼠血清cTnI濃度、心肌梗死面積、心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表達上具有主效應，糖尿病大鼠組的血清cTnI濃度升高，心肌梗死面積增加，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表達減少，p62表達增多，心肌缺血再灌注損傷加重，但心肌線粒體自噬水平降低，提示糖尿病因素可能導致心肌細胞線粒體自噬過程受阻，心肌細胞未能及時清除缺血再灌注過程中受損或功能障礙的線粒體，進而增加活性氧的釋放，加重心肌缺血再灌注損傷。適度的線粒體自噬水平對于維持心臟的正常生理功能具有重要作用，自噬過程受阻會導致受損傷的線粒體未能及時清除進而加重心肌損害；線粒體自噬過度又會導致線粒體減少供能不足。七氟醚后處理減輕非糖尿病大鼠的缺血再灌注損傷，但對于糖尿病大鼠心肌保護作用失效，其機制可能與糖尿病大鼠線粒體自噬水平降低有關。鑒于本研究為在體實驗，無法排除神經體液因素的影響，因此有待于開展離體實驗研究進一步證實。

綜上所述，七氟醚后處理對糖尿病大鼠的心肌保護作用減弱，其機制可能與糖尿病大鼠的心肌線粒體自噬水平降低有關。