水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)及生理代謝的影響

姜立生，陳 瑋，李寶山，孫永智，王際英，黃炳山，王世信

（山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264006）

水解蛋白是利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)將傳統(tǒng)蛋白原料進(jìn)行水解而獲得的，因其中含有大量的小肽，易于消化吸收，水解蛋白原料也逐漸被應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中［1-2］。研究表明：低魚粉飼料中添加5.5%水解魚蛋白［3］或 10%磷蝦水解物［4］可以提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）對(duì)飼料氨基酸的利用，12.5%的羽毛水解物替代飼料中76%的魚粉不影響歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）的生長(zhǎng)［5］，飼料中添加3%～5%的酵母水解物能有效改善凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）生長(zhǎng)性能、提高飼料利用率、促進(jìn)消化吸收以及改善腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)［6］，水解豆粕部分替代魚粉可提高星斑川鰈（Platichthys stellatus）幼魚的生長(zhǎng)性能和飼料利用效率［7］。此外，也有研究表明，不同來源的水解蛋白對(duì)花鱸（Lateolabrax japonicus）的生長(zhǎng)及體成分的影響也不相同［8］。目前關(guān)于水解蛋白替代魚粉的研究主要集中在生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及腸道健康等方面，且在大多數(shù)的報(bào)道中水解蛋白的適宜添加量較低。水解蛋白中的小肽分為營(yíng)養(yǎng)性小肽和功能性小肽，營(yíng)養(yǎng)性小肽可降低機(jī)體吸收時(shí)的能耗，促進(jìn)攝食，顯著促進(jìn)生長(zhǎng)；功能性小肽影響機(jī)體生理代謝，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)素的利用；此外，水解蛋白中含有某些生理活性物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)可執(zhí)行多種生理功能［2］。飼料中添加水解蛋白勢(shì)必會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的代謝生理、尤其是內(nèi)分泌生理產(chǎn)生影響。

大豆?jié)饪s蛋白（soybean protein concentrated）因其粗蛋白含量與魚粉相當(dāng)、且氨基酸組成相對(duì)平衡，而被廣泛應(yīng)用于漁用飼料中。研究表明：大豆?jié)饪s蛋白可以替代大黃魚（Larimichthys crocea）［9］配合飼料中20%及75%的魚粉。而劉興旺等［10］研究表明大豆?jié)饪s蛋白會(huì)對(duì)大菱鲆飼料的適口性產(chǎn)生影響，從而不適宜應(yīng)用于大菱鲆配合飼料中。因此，本研究分別用水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白全部替代飼料中的魚粉蛋白，研究對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)及代謝生理的影響，以期為水解蛋白在水產(chǎn)配合飼料中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料與制作

以魚粉和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，魚油為脂肪源，設(shè)計(jì)粗蛋白含量為50%、粗脂肪含量為10%的基礎(chǔ)飼料配方。分別以水解魚粉（99%＜3 000 Da）和水解大豆?jié)饪s蛋白（36% ＜3 000 Da）替代飼料中的魚粉，制作3組等氮等能的實(shí)驗(yàn)飼料，分別命名為 FM（fishmeal）、HF（hydrolyzed fishmeal）、HS（hydrolyzed soybean meal）組，實(shí)驗(yàn)飼料組成及基本成分見表1，實(shí)驗(yàn)所用的魚粉、水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白基本成分及氨基酸組成見表2。水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白為本實(shí)驗(yàn)室酶解制作，制作流程見文獻(xiàn)［7］。飼料制作時(shí)各固體原料（過60目標(biāo)準(zhǔn)篩）采用逐級(jí)混勻法混勻后，加入新鮮魚油和蒸餾水，再次混勻后用小型飼料擠壓機(jī)制成直徑分別為3 mm和5 mm的顆粒，60℃烘干后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用魚購(gòu)自山東省蓬萊宗哲養(yǎng)殖有限公司。實(shí)驗(yàn)開始前，將500尾大菱鲆幼魚放養(yǎng)于系統(tǒng)中，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。2周后挑選規(guī)格整齊、健康體壯的魚180尾，平均體質(zhì)量（58.50±0.65）g。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)飼料組，每個(gè)飼料組3個(gè)平行。將實(shí)驗(yàn)用魚平均置于9個(gè)綠色養(yǎng)殖水桶中（直徑70 cm，水深45 cm），每個(gè)桶20尾魚，日投喂 2次（8∶00、16∶00），飽食投喂，初始日投喂量為魚體質(zhì)量的1.5%，投喂30 min后，從系統(tǒng)自帶的收集裝置排出殘餌，數(shù)顆粒計(jì)算殘餌量，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)56 d。實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)條件為：水溫（18±0.5）℃，溶氧 ＞5 mg·L-1，非離子氨和亞硝酸氮含量均＜0.01 mg·L-1，鹽度28～30。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及其基本營(yíng)養(yǎng)成分Tab．1 Formulation and approximate composition of experimental diet （%）

表2 飼料蛋白原料基本成分及氨基酸組成Tab．2 Composition and amino acids profiles of diet protein ingredients （%）

1.3 樣品采集與測(cè)定

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)用魚饑餓24 h，用MS-222（30 mg·L-1）麻醉后，稱魚體質(zhì)量、計(jì)數(shù)量，計(jì)算增重率及成活率。每組隨機(jī)取10尾魚，逐尾稱重后，用無菌注射器尾靜脈取血，血液置于4℃冰箱內(nèi)4 h后，3 000 r·min-1離心，分離血清。取血后的魚置于冰盤上解剖，分離肌肉、內(nèi)臟，然后從內(nèi)臟團(tuán)中分離出肝胰臟、腸道、脾臟，分別稱重并測(cè)量腸道長(zhǎng)度，用于計(jì)算臟體比、肝體比、腸體比、脾體比及腸長(zhǎng)比。肌肉及血清樣品均保存于-80℃冰箱中，待測(cè)。

生長(zhǎng)及形體指標(biāo)：

增重率（weight gain rate，WGR，%）＝100×（Wf-Wi）／Wi；

特定 生 長(zhǎng) 率 （specific growth rate，SGR，%·d-1）＝100×（ln Wf-ln Wi）／56；

飼料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）＝FI／WG；

日攝食率（daily feeds intake，DFI，%）＝100×FI／［（Wi+Wf）／2×56］；

蛋白質(zhì)效率（protein efficiency ratio，PER，%）＝100×WG／（FI×CP）；

成活率（survive rate，SR，%）＝100×Ns／20；

臟體比（viseraosomatic index，VSI，%）＝100×WV／WB；

肝體比（hepatosomatic index，HSI，%）＝100×WH／WB；

腸體比（ratio of intestine weight to body weight，ISI，%）＝100×WI／WB；

脾體比（ratio of spleen weight to body weight，SSI，%）＝100×WS／WB；

腸長(zhǎng)比（ratio of intestine length to body length，IBR，%）＝100×LI／LB；

式中：Wf為均末體質(zhì)量（g）；Wi為均初體質(zhì)量（g）；FI為攝食量（g）；WG為實(shí)驗(yàn)用魚的增重量；CP為飼料中粗蛋白含量（%）；Ns為存活尾數(shù)；WV為內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量（g），WB為體質(zhì)量（g）；WH為肝胰臟質(zhì)量（g）；WI為腸道質(zhì)量（g）；WS為脾臟質(zhì)量（g）；LI為腸道長(zhǎng)度；LB為體長(zhǎng)（cm）。

基本營(yíng)養(yǎng)成分：

水分采用105℃恒重法測(cè)定（GB／T6435-2006），粗蛋白采用杜馬斯燃燒法測(cè)定（Leco FP528，USA），粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定（GB／T6433-2006），粗灰分采用灰化法測(cè)定（GB／T6438-2007），能量采用氧彈儀燃燒法測(cè)定（Parr 6100，USA）［7］。

血清生化指標(biāo)測(cè)定：

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amino transferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate amino transferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定（Hitachi7020，Japan），試劑購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司。

血清生理指標(biāo)測(cè)定：

血清中生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）、皮質(zhì) 醇 （cortisol， COS）、去 甲 腎 上 腺 素（noradrenaline，NE）、三碘甲狀腺原氨酸（three iodine thyroid，T3）、補(bǔ)體3（complement 3，C3）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）采用Elisa試劑盒測(cè)定（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）測(cè)定，測(cè)定方法及活力單位設(shè)定見文獻(xiàn)［7］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），差異顯著時(shí)（P＜0.05），采用 Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)及形體指標(biāo)的影響

由表3可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉，均顯著降低了試驗(yàn)魚的增重率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率（P＜0.05），提高了飼料系數(shù)（P＜0.05），但是對(duì)成活率無顯著性影響（P＞0.05）。水解魚粉組試驗(yàn)魚的生長(zhǎng)性能及飼料利用效率顯著高于水解大豆?jié)饪s蛋白組（P＜0.05）。

2018年11月8日下午3時(shí)，隨著汽笛聲傳來，由白俄羅斯開往重慶的第三趟傳化乳制品直達(dá)班列順利抵達(dá)團(tuán)結(jié)村中心站。該班列由41個(gè)集裝箱組成，滿載白俄羅斯優(yōu)質(zhì)乳制品，全程8000多公里，歷時(shí)12天。這是繼今年首趟重慶直達(dá)白俄羅斯班列開通后雙方的再一次深入合作，也是白俄羅斯到中國(guó)的首個(gè)整裝班列，當(dāng)天舉行了隆重的接車活動(dòng)。

水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，對(duì)試驗(yàn)魚的臟體比、肝體比、腸體比、腸長(zhǎng)比均無顯著影響（P＞0.05），但降低了脾體比（P＜0.05）。水解大豆?jié)饪s蛋白組試驗(yàn)魚肥滿度顯著高于其他組（P＜0.05）

2.2 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚肌肉基本成分的影響

由表5可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后顯著提高了試驗(yàn)魚肌肉中水分含量（P＜0.05），降低了粗蛋白含量（P＜0.05），但是對(duì)粗脂肪及粗灰分含量無顯著影響（P＞0.05）。

表3 水解蛋白對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)的影響Tab．3 Effects of dietary hydro-protein on growth performance of S．maximus juveniles

2.3 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚血清生化指標(biāo)的影響

由表6可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，試驗(yàn)魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力有顯著升高（P＜0.05），總蛋白、白蛋白、甘油三酯、總膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇含量均有了顯著降低（P＜0.05）。3組魚血清中低密度脂蛋白膽固醇含量無顯著差異（P＞0.05）。目前關(guān)于大菱鲆血清生化指標(biāo)的報(bào)道相對(duì)較多，本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得指標(biāo)均在參考范圍之內(nèi)。

表4 水解蛋白對(duì)大菱鲆幼魚形體指標(biāo)的影響Tab．4 Effects of dietary hydro-protein on figure index of S．maximus juveniles

表5 水解蛋白對(duì)大菱鲆幼魚肌肉基本成分的影響Tab．5 Effects of dietary hydro-protein on muscle compositions of S．maximus juveniles（%wet weight）

表6 水解蛋白對(duì)大菱鲆幼魚血清生化指標(biāo)的影響Tab．6 Effects of dietary hydro-protein on biochemical indices of serum of S．maximus juveniles

2.4 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚血清生理指標(biāo)的影響

由表7可見，水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，試驗(yàn)魚血清中生長(zhǎng)激素、三碘甲狀腺原氨酸含量及己糖激酶活力均無顯著變化（P＞0.05）；水解魚粉組皮質(zhì)醇含量顯著高于其他兩組（P＜0.05），補(bǔ)體3含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），其他兩組之間無顯著差異（P＞0.05）；水解大豆?jié)饪s蛋白組去甲腎上腺素含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），其他兩組之間無顯著差異（P＞0.05）；水解大豆?jié)饪s蛋白組免疫球蛋白M含量顯著高于魚粉組（P＜0.05），水解魚粉組與其他二組均無顯著差異（P＞0.05）；魚粉組丙酮酸激酶活力顯著高于大豆?jié)饪s蛋白組（P＜0.05），顯著低于水解魚粉組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)、形體指標(biāo)及體成分的影響

本實(shí)驗(yàn)中，水解蛋白完全替代魚粉后，試驗(yàn)魚的生長(zhǎng)性能和飼料利用效率均有了顯著降低，這與其他研究者的報(bào)道較為一致［5-7］。目前關(guān)于水解蛋白的研究報(bào)道中，水解蛋白替代魚粉適宜比例為15%～76%，且在魚飼料中的替代量顯著高于蝦，過量添加則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)有抑制作用［5，21］。但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不同的蛋白水解物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物影響并不一致，水解魚粉蛋白的完全替代效果顯著優(yōu)于水解大豆?jié)饪s蛋白。蛋白質(zhì)水解后會(huì)產(chǎn)生低分子量的肽，可以促進(jìn)動(dòng)物的攝食并降低消化吸收及合成過程中的能耗［22］，因此低濃度添加時(shí)，可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)；當(dāng)飼料中低分子量肽含量過高時(shí)，會(huì)影響其他結(jié)構(gòu)氨基酸的吸收，破壞蛋白質(zhì)的氨基酸平衡，導(dǎo)致氨基酸氧化，從而降低動(dòng)物的生長(zhǎng)［23］。

目前，有研究報(bào)道水解蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用與其中小肽的生物活性有關(guān)［24］。但蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小肽的結(jié)構(gòu)和功能存在較大差異［25］，在水解過程中是否失活，穿越腸道屏障后是否存在生理活性［26］等均存在不確定性。本實(shí)驗(yàn)中水解魚粉的替代效果優(yōu)于水解大豆?jié)饪s蛋白，這與它們的水解度及氨基酸組成（水解大豆?jié)饪s蛋白中蛋氨酸和賴氨酸含量較低）存在較大差異有關(guān)［1］，這也是造成二者之間生長(zhǎng)存在差異的原因之一。因此，在水解蛋白的使用中，仍需進(jìn)一步研究以確定其中的功能性或營(yíng)養(yǎng)性成分的種類及含量。

水解蛋白的使用效果與水解蛋白的添加比例、來源及水解度有密切關(guān)系［3，21，27］。在相當(dāng)多的研究報(bào)道中，水解蛋白替代魚粉對(duì)試驗(yàn)魚的臟體比、肝體比、肌肉基本成分含量均無顯著影響［8，28］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之較為一致。本實(shí)驗(yàn)中，水解蛋白替代魚粉提高了肌肉中水分含量，間接降低了大菱鲆肌肉粗蛋白含量（粗蛋白含量占干物質(zhì)的比例并沒有顯著變化），與對(duì)珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀ ×E.lanceolatus♂）的研究結(jié)果一致［21］。

表7 水解蛋白對(duì)大菱鲆幼魚血清生理指標(biāo)的影響Tab．7 Effects of dietary hydro-protein on physiological indices of serum of S．maximus juveniles

3.2 水解蛋白替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚血清生化生理指標(biāo)的影響

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是評(píng)價(jià)機(jī)體肝臟功能的重要指標(biāo)，雖然本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得酶活力在參考范圍之內(nèi)，但水解蛋白替代魚粉顯著提高了二者的活力，表明水解蛋白給試驗(yàn)魚肝臟造成了損傷［29］，且水解大豆?jié)饪s蛋白對(duì)肝臟的損傷高于水解魚粉。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，水解蛋白引起大菱鲆肝臟損傷的原因可能與水解蛋白的水解度有關(guān)［23］，也與水解蛋白中氨基酸和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)［6-7］。

血清總蛋白和白蛋白含量也是肝臟功能的重要指標(biāo)之一，與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)［23］。本研究中，水解蛋白替代魚粉降低了試驗(yàn)魚血清中總蛋白和白蛋白含量，這與在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［30］中的研究結(jié)果一致，但對(duì)草魚（Ctenoparyngodon idellus）［31］的研究表明，血清蛋白不受飼料組成的影響，這可能與飼料中蛋白質(zhì)的形式有關(guān)。水解蛋白中含有豐富的小分子肽，其吸收與結(jié)構(gòu)氨基酸不同步，從而降低了血清中蛋白含量。

血脂指標(biāo)的變化反應(yīng)了機(jī)體脂肪代謝的變化，血脂中的主要成分是甘油三酯和膽固醇，其中甘油三酯參與能量代謝，膽固醇則主要用于合成細(xì)胞漿膜、類固醇激素和膽汁酸。在已有的報(bào)道中，飼料中添加水解蛋白，影響了黃顙魚［30］、花鱸［8］、星斑川鰈［7］的血脂指標(biāo)，但對(duì)黃顙魚［28］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）［32］的血脂指標(biāo)均無影響。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的血清生理指標(biāo)包含了激素、免疫及糖代謝3個(gè)方面，且攝食不同蛋白源對(duì)各方面的影響不盡相同。本研究中，不同蛋白原料對(duì)試驗(yàn)魚的生長(zhǎng)激素和三碘甲狀腺原氨酸含量均無顯著影響，但顯著影響了皮質(zhì)醇和去甲腎上腺素的含量，表明水解蛋白對(duì)試驗(yàn)魚造成了脅迫，但水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白對(duì)魚體造成脅迫的原因是不同的。補(bǔ)體3和免疫球蛋白M是魚體免疫能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中補(bǔ)體3是抵抗微生物感染的重要物質(zhì)，免疫球蛋白M具有強(qiáng)大的殺菌、激活補(bǔ)體、免疫調(diào)理和凝集作用。本實(shí)驗(yàn)中，水解魚粉降低了試驗(yàn)魚補(bǔ)體C3的含量，而水解大豆?jié)饪s蛋白提高了免疫球蛋白M的含量，表明二者影響魚體免疫能力機(jī)理的不同。己糖激酶和丙酮酸激酶是生物體糖代謝過程中的關(guān)鍵酶，其中己糖激酶專一性差、Km值低、易飽和，活力較難發(fā)生變化［33］；丙酮酸激酶活力的變化表明機(jī)體對(duì)糖利用能力的差異，也反應(yīng)了機(jī)體供氧能力的差異。研究表明，飼料糖來源及含量［34］、環(huán)境脅迫［35］均能影響魚體丙酮酸激酶的活力。本實(shí)驗(yàn)中不同飼料蛋白源對(duì)丙酮酸激酶活力的影響差異較大，這反應(yīng)了不同蛋白源中功能性物質(zhì)的差異。