5種文蛤屬貝類線粒體基因密碼子偏好性分析

張志東，陳愛華，吳楊平，張 雨陳素華，曹 奕，曹廣勇，田 鎮

（江蘇省海洋水產研究所，江蘇省文蛤良種場，江蘇省海洋經濟貝類研發中心，江蘇南通 226007）

文蛤屬（Meretrix）貝類隸屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibrabchia），簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），廣泛分布于中國、朝鮮半島、日本、亞丁灣和阿曼灣等海域。據報道，文蛤屬貝類在我國主要有文蛤（M.meretrix）、麗文蛤 （M.lusoria）、斧文蛤 （M.lamarckii）、短文蛤（M.petechialis）和皺肋文蛤（M.lyrata）等幾種［1］，但其外形相似度高，故很多人將文蛤屬貝類籠統地稱為“文蛤”，忽略了種間進化的差異。長期以來，文蛤分類存在著分歧和混亂現象，已影響和制約了我國文蛤的水產養殖和遺傳育種等相關研究［2］。

密碼子的偏好性不僅能夠反映物種的進化關系，也對研究自然選擇、遺傳漂變以及基因重組等［3-6］普遍現象具有重要意義。密碼子是生命遺傳信息傳遞過程中的基本單位。密碼子共有64種，但是實際上編碼成的氨基酸只有20種，這就存在某些多個密碼子編碼同一種氨基酸的現象，被稱為密碼子的簡并性［7］。正是由于該特性，每個氨基酸至少對應1種密碼子（如 Met、Trp），最多可以有1種氨基酸對應6種密碼子（如Leu、Ser等）。但這些編碼相同氨基酸的不同密碼子，在不同物種、不同生物體中使用的頻率并非完全地平均分布，僅有一部分為常用的密碼子，該現象也稱為密碼子的偏好性。

不同基因密碼子使用的偏好性存在一定的差異［2］。線粒體 DNA（mtDNA）基因組是獨立于核基因組之外的雙鏈DNA分子，記載著豐富的生物進化過程信息，與核基因組相比，其具有進化速度快、無組內特異性等特點，可作為鑒定物種起源與進化最有利的工具［8］。一般情況下線粒體基因組包含13個蛋白質編碼基因，即COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、Cytb、ATP6以及 ATP8［9-10］。然而據王健等［11］的研究發現，文蛤線粒體中無ATP8基因，且ND4L與ND3序列長度較短，為保證序列比對的準確性，本文取5種文蛤屬貝類與青蛤（Cyclina sinensis）（青蛤作為參照）線粒體基因組COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND4、ND5、ND6、Cytb、ATP6基因編碼蛋白（CDS）序列進行密碼子偏好性分析，為探討種屬差異和近緣種之間的親緣關系提供不同視角，以期為進一步開展文蛤功能基因表達調控研究、蛋白質結構和功能的預測以及分子育種等工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

貝類線粒體基因組CDS序列均來源于NCBI數據庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）。選取各物種mtDNA編碼蛋白質的基因序列中長度大于400 bp的 CDS序列，每物種各10個基因（COX1、COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5、ND6）。

表1 6種貝類基因序列號Tab．1 Accession of gene in six species of clams

1.2 分析指標

相對同義密碼子使用頻率（relative synonymous codon usage，RSCU）是指對某種特定密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的使用概率［12］。當密碼子RSCU值大于1時，代表該密碼子為使用較多的密碼子；當密碼子RSCU值小于或等于1時，表示該密碼子使用頻率偏低。計算公式如下：

式中，xij是第i個氨基酸的第j個密碼子的出現次數；n指編碼第i個氨基酸的同義密碼子的數量（n為1～6之間的整數）；x是指編碼第i個氨基酸的同義密碼子總出現次數的平均值。

1.3 分析方法

用Codon W軟件對5種文蛤線粒體基因組CDS序列分別進行分析，并計算相對同義密碼子使用頻率（RSCU）。用Excel 2007對數據進行統計，以SPSS 16.0對其密碼子的偏好性進行聚類分析，最后用MEGA 5.0分析序列，采用鄰接法構建進化樹，最后將聚類結果與進化樹結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 6種貝類線粒體基因組CDS序列的密碼子偏好性

A3s、C3s、G3s、U3s分別表示密碼子的第 3位堿基中A、C、G、U的含量在第3位堿基總量中所占的比率。5種文蛤屬貝類線粒體基因CDS序列中的 U3s分別為文蛤 57.83%、麗文蛤56.87%、皺肋文蛤63.23%、短文蛤58.03%、斧文蛤59.22%，青蛤則為60.34%，均大于 A3s、C3s、G3s（表2），可見5種文蛤屬貝類偏愛使用以U結尾的密碼子。尤其是UCU、ACU、CCU和GCU，它們的RSCU值均接近3，為5種文蛤屬貝類與青蛤最常用的密碼子。

用Codon W和Excel計算的結果表明（表3）：在文蛤屬貝類線粒體基因組中的密碼子中UUU、UAU、CAU等24個密碼子的RSCU值均大于1，為文蛤屬貝類偏好性密碼子。但5種文蛤屬貝類的密碼子偏好性有所不同：麗文蛤與短文蛤編碼異亮氨酸（Ile）的偏好密碼子只有1個AUU，其余貝類不僅有AUU，還有AUA；皺肋文蛤編碼谷氨酸（Glu）的偏好性密碼子為GAA，其余貝類為GAG；皺肋文蛤編碼甘氨酸（Gly）的偏好密碼子中無GGG，與其余貝類存在些差異；斧文蛤編碼谷氨酰胺（Gln）的偏好密碼子為CAG，其余貝類均為CAA；斧文蛤編碼甘氨酸（Gly）的偏好密碼子 GAA和 GGG，其余貝類為 GGU與GGG。青蛤編碼亮氨酸的偏好密碼子無UUG。

表2 6種貝類 CDS序列的 A3s、C3s、G3s、U3sTab．2 Values of A3s，U3s，G3s，C3s in CDS in six species of clams （%）

2.2 6種貝類RSCU值聚類分析

對5種文蛤屬貝類和青蛤的密碼子RSCU值進行聚類分析，除去編碼色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）唯一的密碼子的UGG和AUG，其RSCU值始終為1。再除去3個終止密碼子UAA、UAG、UGA，取余下的59個密碼子的RSCU值對密碼子的偏好性分析。聚類結果見圖1，文蛤和短文蛤先聚為一類，再與麗文蛤聚為一類；接著和皺肋文蛤及斧文蛤聚為一類，最后與青蛤聚為一類。

表3 6種貝類線粒體基因CDS序列偏好密碼子的RSCUTab．3 RSCU values of mtDNA CDS in six species of clams

圖1 6種貝類線粒體基因CDS序列密碼子偏好性聚類圖Fig．1 Cluster tree based on RSCU values of mtDNA CDSin six species of clams

2.3 文蛤屬貝類線粒體基因序列比對構建進化樹

以青蛤為外群，將所研究的5種文蛤屬貝類的10個線粒體基因（COX1、COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5和 ND6）CDS序列用鄰接法聚類分析，其結果如圖2：文蛤與短文蛤在COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5和ND6先聚為一類，再與麗文蛤聚為一類；皺肋文蛤與斧文蛤聚為一類，再與青蛤聚為一類。5種文蛤屬貝類線粒體基因系統進化樹與密碼子偏好聚類分析結果相似。

圖2 鄰接法（NJ）構建的文蛤屬貝類與青蛤線粒體基因CDS序列進化樹Fig．2 NJ phylogenetic tree based on mtDNA CDS in five Meretrix species and C．sinensis

3 討論

基因是生物遺傳信息的載體，蛋白質是發揮生物功能的主要分子。因此聯系兩者的密碼子使用情況必然具有重要的生物學意義。在長期進化過程中，物種的基因會逐漸形成一套適應基因組的特定密碼子用法［13］。文蛤屬貝類線粒體基因組CDS序列偏愛使用U結尾的密碼子，使用頻率最高的是UCU，其次是ACU，而對C結尾的密碼子使用頻率最低。以麗文蛤為例，27個偏好密碼子中以U結尾的有15個，而以C結尾為零，其余4種文蛤屬貝類也與之相似。由于線粒體基因組存在著D-loop區，該區域富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）［14］，這可能與文蛤線粒體基因組CDS序列偏愛使用U結尾的密碼子有關。文蛤核基因組甚至全基因組是否偏愛使用U結尾的密碼子，還需待文蛤全基因組測序完成之后繼續研究。

物種的親緣關系遠近與密碼子偏好性差異大小密切相關。親緣關系近，則密碼子偏好性差異??；親緣關系遠，則密碼子偏好性差異大［15］。宋喬喬等［16］對野牦牛（Bos mutus）、普通牛（Bos taurus）、藏 羚 羊 （Pantholops hodgsonii）、山 羊（Capra hircus）和綿羊（Ovis aries）等哺乳動物線粒體基因密碼子偏好性進行聚類分析，發現基于密碼子偏好性差異可以揭示物種間的親緣關系，并用于物種的分類研究。DUAN等［17］比較了14種鲌亞科魚類密碼子偏好性的差異，發現屬間物種的密碼子偏好性具有物種特異性，主要是受到進化過程中的突變與自然選擇的影響?；蛲蛔兙哂械皖l性，故近緣物種密碼子在使用偏好性上總體相似，又有輕微差別。本研究通過對文蛤屬貝類的密碼子偏好性分析發現，5種文蛤屬貝類密碼子偏好性雖有輕微差別，但總體相似，符合上述近緣種密碼子使用偏好性特點。而青蛤在密碼子使用偏好性方面與文蛤屬貝類有所差異，聚類結果和序列比對結果均顯示青蛤與文蛤屬貝類親緣關系較遠。從密碼子使用偏好性來看，文蛤與短文蛤極為相似，與斧文蛤相似度最小，在親緣關系上很可能亦是文蛤與短文蛤親緣關系最近，與斧文蛤親緣關系最遠。潘寶平等［18］通過16SrRNA基因及ITS1序列的系統學分析，劉澤浩等［19］通過28SrRNA部分序列研究也得出類似結論。

本研究利用生物信息學的方法，在編碼蛋白質水平進行了密碼子偏好性分析，明確了文蛤屬貝類的密碼子偏好性及特征，并比較文蛤與其近緣種的密碼子使用偏好性差異。研究結果可為文蛤屬貝類在進化中親緣關系遠近的判定提供一定依據，并可為未來文蛤功能基因表達調控研究、蛋白質結構和功能的預測以及分子育種等工作提供理論基礎。