羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導等溫擴增LAMP檢測技術(shù)的建立及應用

余艷玲 彭昊 馮世文

摘要：針對羅非魚無乳鏈球菌Sip基因建立了LAMP檢測方法，并對野外樣本進行了無乳鏈球菌的調(diào)查研究。結(jié)果表明，目標Sip基因可在63 ℃ 40 min內(nèi)被LAMP檢測到，比PCR快約2 h，其DNA檢測最低濃度為3.55×10-5 ng/μL，靈敏度比PCR高100倍，且對參考細菌無擴增。野外樣品檢測結(jié)果表明，運用LAMP檢測技術(shù)對GBS的檢出率為81.3%，比PCR高約20.0%。應用LAMP和PCR分別檢測健康羅非魚GBS檢出率4.4%和2.2%，檢測池塘水樣品GBS檢出率分別為10.0%和6.7%。

關(guān)鍵詞：羅非魚;無乳鏈球菌（GBS）;環(huán)介導等溫擴增（LAMP）

中圖分類號：S917 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0200-04

鏈球菌病已成為全球羅非魚最嚴重的疾病之一[1]，每年造成的經(jīng)濟損失達4 000多萬美元[2-3]。過去數(shù)十年，我國羅非魚鏈球病逐年增長，其優(yōu)勢種類已經(jīng)從海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）轉(zhuǎn)變?yōu)闊o乳鏈球菌（S. agalactiae，也稱B族鏈球菌或GBS）。過去5年，由鏈球菌導致的羅非魚死亡率達15%～95%[2]。GBS不僅會引起水生或半水生生物[4-5]，包括野生魚類[6-7]和養(yǎng)殖魚類[8-9]嚴重的疾病，也可導致新生兒嚴重的腦膜炎[10]和成人敗血癥[11-12]。人類或牲畜的GBS對羅非魚具有潛在的感染性[13]，而來自羅非魚的GBS也可能導致人類感染[14]。因此，羅非魚和/或水環(huán)境中GBS菌株的存在增加了公共衛(wèi)生安全的風險，這就需要研發(fā)采取一種快速、靈敏和可靠的污染鏈球菌檢測方法，通過采取適當?shù)姆揽卮胧Ｗo易感染群體免受這種人畜共患病原體的侵襲。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）是一種敏感、快速和低成本的檢測方法，在等溫條件下擴增靶基因核苷酸，通常在 1 h 內(nèi)完成[15-16]，擴增產(chǎn)物可通過濁度或熒光染料監(jiān)測。此外，LAMP檢測可在野外進行，因此可用于現(xiàn)場測定[16]。基于LAMP的優(yōu)點，本研究開發(fā)了一種針對GBS Sip基因可用于野外現(xiàn)場檢測的單步LAMP法，并對其特異性和靈敏性進行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細菌菌株 羅非魚GBS菌株、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、哈氏弧菌（Briohatveyi）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）與海豚鏈球菌（S. iniae），均由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑 細菌全基因組DNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;Loopamp DNA擴增試劑盒購自日本榮研生物科技公司;PCR Master Mix、DNA Marker、鈣黃綠素等，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 待檢樣品 2014年7—9月，從野外共收集樣品490份，其中健康羅非魚樣品45份，患病羅非魚樣品415份及養(yǎng)殖羅非魚的池塘水樣品30份（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的制備 將GBS接種到胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，28 ℃下培養(yǎng)18 h，12 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于200 μL PBS中，采用基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。取10 mg羅非魚腦組織于0.9 mL PBS中清洗，無菌研缽研磨，采用基因組DNA提取試劑盒提取DNA。池塘水經(jīng)離心沉淀后提取DNA。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GBS Sip基因序列（GenBank：HQ878436.1、DQ914255.1-DQ914274.1），采用Primer Explorer version 4（http：/primerexplorer.jp/lamp）設(shè)計GBS的LAMP引物。外部正向引物（F3）引物和反向引物（B3）序列分別為F3：5′-GTAGCAGCCCCTAGAGTG-3′，B3：5′-GTTGTGCTACCGGTGTTG-3′;內(nèi)部正向引物（FIP）和反向引物（BIP）序列分別為FIP：5′-AGCTGATACATGCTCTGGTGATGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTC-3′，BIP：5′-GTTCCTGTGACTACGACTTCAACTTTTGTGCTACCGGAAGG-3′。NCBI BLAST程序檢查引物序列的特異性。引物F3和B3用于PCR擴增，以對比LAMP的靈敏性和特異性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 LAMP反應檢測 采用Loopamp DNA擴增試劑盒進行LAMP反應，反應體系為25 μL，其中FIP和BIP各 40 pmol，F(xiàn)3和B3各5 pmol，2×Reaction Mix 12.5 μL，鈣黃綠素25 μmol/L，Bst DNA聚合酶1 μL，以及3.55×101 ng/μL基因組DNA 2 μL。LAMP反應在LA-320C實時濁度計中進行，在63 ℃測定60 min，然后在80 ℃滅活5 min。以蒸餾水代替DNA模板作為陰性對照。

1.2.4 PCR擴增檢測 采用F3和B3為擴增引物進行GBS的PCR檢測，擴增長度為196 bp。PCR反應總體積為25 μL，包括PCR Master Mix 12.5 μL，引物F3和B3各1 μmol/L、3.55×101 ng/μL基因組DNA 2 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色，Bio-Rad Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.2.5 LAMP檢測的特異性 以GBS菌株作為陽性對照，以蒸餾水作為陰性對照，以大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、愛德華氏菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和與海豚鏈球菌作為參考細菌，進行LAMP的特異性檢測。

1.2.6 LAMP和PCR檢測靈敏度比較 將羅非魚GBS DNA連續(xù)10倍稀釋，稀釋后的濃度范圍為3.55×101～3.55×10-7 ng/μL。應用LAMP和PCR方法分別對其進行檢測，比較2種檢測技術(shù)對GBS DNA的最低檢測濃度。同時，采用直接目視檢測法，LAMP反應在水浴中進行，當LAMP反應終止約1 h后，加入鈣黃綠素染料進行終止反應，利用紫外光照射觀察反應結(jié)果。

1.2.7 野外樣本的檢測 采用LAMP和PCR檢測技術(shù)，分別對收集的490個野外樣本進行了GBS檢測。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測的特異性

以GBS為陽性菌株，蒸餾水為陰性對照，8株羅非魚養(yǎng)殖池塘中常見的細菌為參考菌株，對LAMP引物進行特異性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅GBS能檢測到擴增產(chǎn)物，其他8種參考細菌及陰性對照均無擴增產(chǎn)物（圖1），表明該引物組可用于無乳鏈球菌Sip基因的擴增，因此將引物FIP和BIP用作LAMP反應的引物。

2.2 LAMP檢測的靈敏度

由圖2可知，LAMP和PCR對羅非魚GBS DNA的最低檢測濃度分別為3.55×10-5ng/μL和3.55×10-3 ng/μL，即LAMP檢測靈敏度為PCR的100倍。羅非魚GBS DNA濃度在3.55×101～3.55×10-5 ng/μL間的7個濃度，LAMP反應孵育期分別為33、35、37、41、42、45、53 min（圖2A），可檢測GBS存在的最早時間點小于 40 min。通過直接目視檢測法研究發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測GBS DNA的最低檢測濃度也為3.55×10-5 ng/μL。

2.3 野外樣本的檢測和測序

采用LAMP和PCR檢測技術(shù)，分別對收集的490個野外樣本進行了GBS檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患病羅非魚樣品中，LAMP檢測技術(shù)對GBS的檢出率為81.3%，而PCR對GBS的檢出率為60.72%，LAMP方法對GBS的檢測比PCR更敏感。同時，健康羅非魚樣本中也檢測到GBS，LAMP和PCR技術(shù)的檢出率分別為4.4%和2.2%，其檢測差異較小。利用LAMP和PCR檢測技術(shù)分別對羅非魚養(yǎng)殖池塘水樣品進行檢測，結(jié)果顯示，池塘水的GBS檢出率分別為10.0%、6.7%（表2）。對20個LAMP檢測陽性樣品進行了測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，樣品序列與GBS Sip基因部分序列的相似性為100%。

3 討論

目前，已建立了核糖體基因分型、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）[17-18]和脈沖場凝膠電泳（PFGE）等多種GBS檢測方法[19]，然而僅通過表型檢測GBS可能會有誤導性。一些實驗室將CAMP（Christie-Atkins-Munch-Peterson）作為檢測GBS的一種方法，但CAMP需要連續(xù)2 d過夜培養(yǎng)，非常耗時。PCR或?qū)崟r熒光定量PCR也被用于GBS檢測[20-21]，同時PCR方法需要昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備和試劑消耗，不適用于野外檢測，而且本研究建立的LAMP方法較PCR方法敏感性提高100倍，更適用于GBS的檢測。盡管有關(guān)羅非魚GBS的LAMP檢測方法也有相關(guān)報道[22]，但本研究針對魚類和哺乳動物GBS中高度保守Sip基因序列開發(fā)LAMP檢測方法，與前人建立的比色LAMP測定方法相比，更能進行實時LAMP測定，不需要打開反應管即可獲得檢測結(jié)果，降低了陽性產(chǎn)物污染實驗室的風險。

本研究分別采用LAMP和PCR法檢測了羅非魚和池塘水中的GBS，發(fā)現(xiàn)LAMP檢測靈敏度高于PCR，同樣的樣品，LAMP對羅非魚GBS的檢出率為81.3%，而PCR僅為 60.7%，提示LAMP法更適用于實地檢測GBS，也意味著先前采用PCR檢測羅非魚GBS可能低估了GBS的傳播范圍或GBS引起的死亡率。另一方面，本研究中羅非魚GBS的平均檢出率為81.3%，低于Chen等報道GBS的平均檢出率（97.7%）[2]，這可能是由于2項研究所收集樣品的時間段不同造成的。Chen等收集樣品的時間段為2009—2011年[2]，是我國羅非魚鏈球菌發(fā)病的高峰期，而本研究樣品收集時間為2014年，與其相比，羅非魚鏈球菌病的發(fā)病率較低，故檢出率較低，此外還可能是2項研究中樣本量的差異導致的。

Li等研究發(fā)現(xiàn)，無典型臨床癥狀或死亡的羅非魚或為GBS的載體[23]。本研究的野外樣品檢測結(jié)果顯示，應用LAMP和PCR在健康無癥狀的羅非魚大腦樣品檢測到GBS，與Li等研究的結(jié)果[23]一致，表明羅非魚可能為GBS病原體的無癥狀攜帶者。此外，采用LAMP和PCR分別從池塘水中檢測到GBS，表明GBS可能在野生環(huán)境中正常生長，當羅非魚的免疫反應較弱時才可能感染。雖然目前尚無羅非魚源GBS菌株對人類感染性的研究報道，但應高度關(guān)注野生環(huán)境中GBS能在羅非魚與人類之間傳播，并采取一些切實可行的措施以防止該病發(fā)生。

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