早開堇菜花粉生活力研究

郭英姿 賈文慶 周秀梅

摘要：以早開堇菜新鮮花粉為試材，使用掃描電鏡觀察花粉表觀形態，采用雙重二因素試驗用離體培養法研究不同培養基組分對花粉萌發的影響，篩選最佳的貯藏方法，并探討花粉形態結構與花粉萌發之間的關系。結果表明：蔗糖和硼酸對花粉萌發具有促進作用。在280 g/L蔗糖和240 mg/L硼酸的條件下花粉萌發率最高，為72.29%;在 90 mg/L GA3和200 mg/L Ca（NO3）2的條件下花粉萌發率峰值為82.48%。確定花粉離體培養最佳的培養基為：蔗糖280 g/L、GA3 90 mg/L、Ca（NO3）2 200 mg/L、硼酸240 mg/L?；ǚ勖劝l率隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，相同時間內貯藏溫度越低花粉萌發率越高，早開堇菜花粉最佳的貯藏的條件為-80 ℃;花粉形態與其萌發率之間有相關性。

關鍵詞：早開堇菜;生活力;萌發;培養基成分;貯藏

中圖分類號： S567.23+9.035.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0191-04

早開堇菜（Viola prionantha Bunge）又名早花地丁，為堇菜科堇菜屬多年生草本植物。全草藥用，有活血化瘀，除膿消炎;搗爛涂于患處，可排膿、活血和生肌[1]。植株低矮、春季返青比較早，植株長勢茂盛，在早春和晚秋開花，花期集中，花型奇特、色澤醒目、株型雅致，具有較高的觀賞價值。早開堇菜有適應性廣、生長迅速、抗逆性強、競爭力強等特點，可廣泛用于地被、林下地被、花境、花壇、綴花草坪等，具有廣闊的園林開發應用前景[2-3]。

雜交培育新品種是改良植物的重要途徑，也是植物資源開發利用的主要方法。堇菜屬植物生殖特性的研究是提高堇菜屬植物育種效率的基礎。在進行人工授粉、雜交育種時都需要大量花粉，雜交育種有時因花期不遇、空間障礙等原因，必須有效地貯藏花粉，花粉壽命長短對植物授粉受精結實繁殖能力等方面具有重要意義[4]。在授粉前對花粉進行生活力的測定，可以避免因使用低生活力的花粉而造成育種時間和成本的浪費，以便對雜交結果進行分析和研究[5]。而花粉萌發生活力測定是人工篩選或雜交育種的前提，離體培養法是檢測花粉萌發率最準確的方法之一。花粉長期貯藏對種質保存和雜交育種十分重要，長期保存花粉的必要條件就是低溫處理。目前國內學者對早開堇菜的資源概況[2-3，6]、生物學特性[7]、揮發性成分[1]、抗性[8]等進行了深入的研究，但對其花粉生活力及貯藏的研究尚未見報道。為此本研究采用離體培養法對早開堇菜花粉萌發特性進行探討，探究了早開堇菜花粉萌發的最適培養基及最佳貯藏方法，并分析了花粉形態與萌發率之間的關系，以期為早開堇菜的雜交育種和花粉儲藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的采集與處理

試驗于2017年3月上旬展開，選擇晴天08：30—11：00，在河南科技學院校園內采集早開堇菜初花期含苞待放花朵為宜，此時花粉還未散出，花粉量大、生活力好。帶回實驗室后，一部分用鑷子剝取花藥置于放有硫酸紙的培養皿內，置于（25±1） ℃培養箱內散粉24 h后，收集花粉，待掃描花粉形態備用。一部分新鮮花粉直接用于離體萌發試驗，待測花粉生活力。其余花粉干燥后裝入放有硅膠的離心管密封保存，設置常溫、4 ℃（低溫）、-20 ℃、-80 ℃（超低溫）4種貯藏溫度，進行長期貯藏。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態觀察 將干燥的花粉均勻撒布在黑色導電膠上，放在掃描電鏡下觀察拍照。選取有代表性的花粉粒進行觀察，各類型的花粉粒測20粒，取平均值，記錄花粉的極軸和赤道長度并計算P/E值;觀察花粉遠極面、近極面和局部的外壁紋飾、網眼大小、網脊寬度，測量并記錄數據。

1.2.2 不同蔗糖、硼酸處理對花粉萌發的影響 試驗采用二因素完全隨機處理方法，共36個組合，濃度梯度分別為：蔗糖：蒸餾水作為對照，蔗糖濃度設為200、230、260、280、310 g/L;硼酸：蒸餾水作為對照，硼酸濃度設為200、220、240、260、280 mg/L。各培養基均加入9 g/L瓊脂、pH值調至5.8。用玻璃棒滴培養液于凹玻片的凹處，裝滿為止，稍冷卻后用干凈的毛筆蘸取少許花粉均勻撒播于培養基表面。將凹玻片放入鋪有濕濾紙的培養皿內。置于（25±1） ℃恒溫培養箱、相對濕度保持70%～80%，暗培養15 h后，放在NIKON 50i顯微鏡下拍照并統計萌發率?；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑視為萌發，每處理重復3次，每重復觀察3個視野，每視野≥100粒花粉，統計萌發率[9-10]。

花粉萌發率=花粉萌發粒數/花粉總粒數×100%。

1.2.3 不同赤霉素、硝酸鈣處理對花粉萌發的影響 在試驗得出的最佳培養基中加入GA3、Ca（NO3）2，在此基礎上采用二因素完全隨機處理試驗，依據不同處理的花粉萌發率，確定最佳的GA3和Ca（NO3）2濃度。濃度梯度分別為：GA3：蒸餾水作為對照，GA3濃度設為30、60、90、120、150 mg/L，Ca（NO3）2：蒸餾水作為對照，Ca（NO3）2濃度設為50、100、150、200、250 mg/L，pH值調至5.8?；ǚ勖劝l的測定方法同上。

1.2.4 不同貯藏溫度對早開堇菜花粉萌發的影響 將真空干燥的花粉，設置常溫、4 ℃（低溫）、-20 ℃、-80 ℃（超低溫）4種貯藏溫度，將花粉裝入放有硅膠干燥劑的5 mL試管中，用棉花封口。貯藏60、120、180、240、300、360 d后，分別從4種貯藏條件的離心管中各取出少許花粉（-80 ℃下貯藏的花粉放-20 ℃預處理解凍，在-20 ℃冰箱中冷凍的花粉應在 4 ℃ 的冰箱中緩沖15 min后再培養），取少許采用試驗所得最佳培養基培養測定萌發率，以新鮮花粉的萌發率作對照，測定方法同上。

1.3 數據分析

采用DPS數據分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 早開堇菜表觀形態

從圖1-A、圖1-B可以看出早開堇菜花粉粒均為長橢球形，早開堇菜花粉粒平均極軸長為21.93 μm，平均赤道軸長約10.08 μm，P/E≈2.176，屬于小型花粉。其中少數呈船型或不規則形狀。從圖1-B、圖1-C、圖1-D可以看出，早開堇菜花粉表面較為光滑，為小穴狀雕飾紋，網脊細而彎曲，較為均勻。早開堇菜花粉粒形態呈兩側對稱，花粉赤道面觀長橢圓形，兩端漸窄，極面觀三裂圓形，花粉具3孔溝[11]，溝膜較明顯，延伸至兩極，萌發溝呈兩極寬中間窄，溝寬約 0.88 μm，溝長快達到花粉粒兩端，長度平均約18.02 μm，溝區有光滑的溝膜。

2.2 蔗糖、硼酸對花粉萌發率的影響

不同蔗糖、硼酸濃度對早開堇菜花粉萌發的影響差異顯著（表1、圖2）。表1表明，早開堇菜在蔗糖、硼酸濃度都為0和單獨添加蔗糖或者硼酸時萌發率都較低，在恒溫培養箱（25±1） ℃持續培養15 h后，空白培養基花粉的萌發率僅為20.27%，單獨使用蔗糖時，隨著蔗糖濃度的增加，花粉的萌發率呈先上升后降低的趨勢。蔗糖濃度為280 g/L，萌發率最高，達25.76%，顯著高于其他處理;但隨著蔗糖濃度持續增加，花粉的萌發率呈下降趨勢，在蔗糖的濃度為300 g/L時，花粉萌發率降至22.91%。

硼能促進糖的吸收與代謝，且有利于花粉管壁的形成，減少花粉破裂，提高花粉的萌發率，促使花粉管生長伸長[7]。表1結果顯示，單獨使用硼酸時，早開堇菜花粉萌發率隨著硼酸質量濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。硼酸的質量濃度為240 mg/L時，早開堇菜的花粉萌發率最高，達31.74%;隨著硼酸濃度持續增加，花粉萌發率顯著下降，當硼酸的質量濃度為280 mg/L時，花粉的萌發率僅為26.82%。

這表明高質量濃度蔗糖、硼酸對花粉萌發有抑制作用。研究結果顯示：供試的36種培養基中，蔗糖和硼酸濃度分別為280 g/L、240 mg/L時，花粉萌發率最高，達72.29%，顯著高于其他組合，可以表明該培養基為早開堇菜花粉萌發的最佳培養基。這表明添加一定含量的蔗糖、硼酸對早開堇菜花粉萌發具有明顯的促進作用。

2.3 赤霉素、硝酸鈣對花粉萌發率的影響

赤霉素是影響花粉萌發的重要因素之一。由表2可以看出，赤霉素添加后，早開堇菜花粉萌發率有較顯著的變化，呈先增加后降低的趨勢。赤霉素為90 mg/L時，萌發率達到了峰值，為78.34%，當赤霉素濃度為150 mg/L時，萌發率隨赤霉素濃度增加反而下降，為57.14%， 這表明高質量濃度的赤霉素使花粉萌發受到抑制。

硝酸鈣對早開堇菜花粉的萌發具有一定的相關性。硝酸鈣晶體易溶于水，可以隨其他易溶試劑直接加入蒸餾水中配制培養基。由表2可知，在最佳蔗糖濃度280 g/L的培養基中加入Ca2+后，很明顯抑制了早開堇菜花粉的萌發，隨著硝酸鈣質量濃度不斷增大，花粉萌發率呈先增加后下降的趨勢，硝酸鈣濃度為250 mg/L時，早開堇菜花粉萌發率降至 69.87%，萌發率明顯低于無硝酸鈣時的72.29%。Ca（NO3）2的質量濃度為200 mg/L時，早開堇菜花粉的萌發率達到頂峰值，為72.82%。

供試的36種培養基中，赤霉素和硝酸鈣濃度分別為 90 g/L、200 mg/L時，花粉萌發率最高，達82.48%，顯著高于其他組合。綜上所述，依據不同組合的花粉萌發率，確定早開堇菜花粉萌發的最適培養基為：蔗糖280 g/L+GA3 90 mg/L+Ca（NO3）2 200 mg/L+硼酸240 mg/L。

2.4 不同貯藏時間和溫度對早開堇菜花粉萌發的影響

圖3結果表明，貯藏環境對早開堇菜花粉的萌發率影響顯著，貯藏不同時間后花粉活力差異較大。在4種貯藏溫度條件下，隨著貯藏時間延長，早開堇菜花粉萌發率均呈下降趨勢。室溫下萌發率下降最快，貯藏120 d后，花粉幾乎喪失生活力，貯藏時間最短;與室溫相比，4 ℃條件下花粉貯藏時間明顯延長，隨著貯藏時間的延長，萌發率呈緩慢下降的趨勢，貯藏360 d萌發率下降到38.8%;-20 ℃貯藏條件下，花粉萌發率下降趨勢較4 ℃條件下的小很多，貯藏360 d后萌發率仍有52.91%;-80 ℃條件下貯藏的花粉萌發率下降幅度較小，變化曲線較平緩，顯著優于4 ℃和-20 ℃，貯藏360 d后，花粉萌發率仍達61.69%，花粉管形態正常。綜上所述，適宜早開堇菜花粉貯藏的條件為-80 ℃。

3 小結與討論

花粉形態是植物分類鑒定、確定親緣關系遠近的重要指標。物種不同，花粉的形態、結構及大小也有差異[12]。本研究結果表明：早開堇菜屬于小型花粉，表面光滑，早開堇菜畸形花粉所占比率（13.18%），與離體萌發法所得萌發率（82.48%）結合來看，二者具有一定關系，說明花粉萌發與花粉形態有相關性。分析出現畸形花粉原因可能是早開堇菜繁殖力差，花粉敗育。

離體萌發法操作簡便、快速，結果直觀可靠，幾乎適用于所有植物的花粉生活力測定，但不同的材料需要不同的培養基[13]。本試驗通過二因素完全隨機處理試驗，篩選出最適宜早開堇菜花粉萌發的培養基組合為：蔗糖280 g/L+GA3 90 mg/L+Ca（NO3）2 200 mg/L+硼酸240 mg/L。

蔗糖是花粉萌發的營養物質和能量來源，不同植物種類甚至品種其花粉離體培養對蔗糖濃度要求不同。這可能是由于不同植物、品種的花粉細胞中內含物含量不同，要求適宜的細胞壁內外滲透壓才能生長。胞內滲透壓低于胞外，易造成胞內水分外滲，高于胞外則造成細胞過分膨脹，都不利于花粉細胞生長[14]。本研究結果表明，蔗糖是影響早開堇菜花粉萌發的主要因子，蔗糖的質量濃度為280 g/L時，花粉萌發效率達到峰值，當蔗糖的質量濃度超過280 g/L時，萌發率和蔗糖質量濃度成反比，原因可能是蔗糖質量濃度低，滲透壓就比較低，會導致花粉壁破裂，內容物流出，花粉萌發率降低;蔗糖的質量濃度高時，發生質壁分離，又阻礙了花粉的發育[15]。適量硼也是花粉萌發和生長所必需的，硼酸有助于糖的吸收和利用，提高新陳代謝，硼還參與早開堇菜花粉組織的形成，可以減少花粉破裂，提高耗氧速度，有利于花粉管組織的合成和花粉管的伸長生長[16-19]，本試驗結果顯示：硼酸的質量濃度為240 mg/L時，早開堇菜的花粉萌發率達到峰值，為31.74%;隨著硼酸濃度持續增加，萌發率隨硼酸質量濃度的增大而降低，分析可能的原因是硼的含量過多，抑制了花粉的新陳代謝，從而影響和抑制花粉活力。赤霉素可刺激花粉的萌發，促進花粉管生長，提高萌發率。大部分赤霉素促進花粉萌發的研究結果顯示：50 mg/L以下的低濃度赤霉素對花粉萌發和花粉管生長有明顯的促進作用[8]。本研究結果表明，90 mg/L GA3對早開堇菜花粉萌發具有明顯的促進作用，這表明，低濃度的赤霉素能促進早開堇菜花粉萌發，120 mg/L的GA3出現抑制作用。Ca2+誘導花粉管產生一定的趨向性，使花粉管朝Ca2+濃度高的方向生長。硝酸鈣的主要作用是提供鈣元素，補充氮元素，具有快速補給鈣、氮的特點[16，20]。Ca2+的濃度影響著花粉管的生長速度和形態特征，但花粉萌發和生長都需要控制在一定的組分濃度內，過高、過低均不利于花粉管的萌發和生長[15]，關于早開堇菜Ca2+誘導花粉管的研究尚未見報道，本試驗結果表明，200 mg/L硝酸鈣對早開堇菜花粉萌發具有促進作用。

本試驗結果顯示，早開堇菜花粉萌發率最高一般維持在80%左右，推斷花粉生活力的強弱主要取決于種（品種）自身的遺傳特性，但培養基、培養溫度等其他外界條件也會影響到花粉萌發率[21-23]，有待于進一步研究。

貯藏溫度影響花粉萌發下降速度[21]，本研究結果表明，在4種貯藏溫度條件下，隨著貯藏時間延長，花粉萌發率均呈下降趨勢，室溫下萌發率下降最快，貯藏時間最短。室溫貯藏120 d后花粉幾乎喪失生活力，可能是因為溫度高增強了花粉內部呼吸強度，從而導致花粉營養枯竭，同時室內溫度、濕度又會使花粉脫水變質死亡[21]。4 ℃貯藏360 d后，萌發率為43.64%，長期貯藏仍表現較高的萌發率，但-80 ℃低溫處理后萌發率最佳，貯藏360 d后萌發率仍達到61.69%，適合花粉長期貯藏。說明溫度越低越有利于早開堇菜花粉的長時間保存，這與大多數研究結果[4，14，21]一致。這是因為花粉在貯藏過程中仍然進行新陳代謝等生命活動，低溫可以使貯藏期間的花粉呼吸減弱，可溶性糖類等消耗減少，從而保持較長時間的生活力[21，24]。與-80 ℃相比，4 ℃條件貯藏的花粉耗能低，節約生產成本。從貯藏效果看，-80 ℃是長期貯藏適宜的溫度。堇菜屬遠緣雜交育種，時?；ㄆ诓挥?，可以利用此方法長期保存花粉，貯藏360 d后正是堇菜屬植物的盛花期，為雜交育種的最佳時期。本實驗室前期研究的牡丹、三色堇 4 ℃ 貯藏120 d后，花粉萌發率基本降為0，推斷原因可能是花粉含水量高、腐爛造成萌發率降低[1，9]。本試驗結果顯示 4 ℃ 經過近1年的貯藏后早開堇菜花粉仍具有較高的生活力，推斷原因可能與前期的花粉干燥程度有關，具體原因有待于進一步研究。

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