2株油菜菌核病拮抗內生細菌的篩選鑒定及其拮抗活性初步分析

李夢霖 阮羽萱 杜可心

摘要：油菜菌核病是一種嚴重危害油菜生長的病害。于2017年3月從湖南農業大學生物科學技術學院試驗田采集油菜湘油15盛花期植株的根莖葉，采用純培養法對內生細菌進行分離純化，共分離得到68株內生細菌;采用基于16S rRNA基因序列的系統發育分析法對內生菌株的多樣性進行分析研究;利用瓊脂擴散法對內生菌株進行抗菌活性篩選，共篩選出7株抗菌活性較強菌株，分別為Y171004、Y172014、Y173005、Y174007、Y174017、Y177001和Y177002;利用平板對峙法對油菜菌核病病原菌核盤菌的拮抗菌進行篩選，篩選出2株（Y171004和Y177002）油菜核盤菌的拮抗細菌，經初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus），繼而對其拮抗活性進行初步分析，其中菌株Y171004的抗菌物質經鑒定為熱不穩定性蛋白。研究結果能為該地區油菜內生細菌資源的進一步研究及其在油菜菌核病生物防治等方面的應用提供試驗依據和理論指導。

關鍵詞：油菜菌核病;內生細菌;拮抗;熱不穩定性蛋白;抗菌活性;新型藥劑開發

中圖分類號： S435.654 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0121-05

油菜（Brassica napus L.）是蕓薹屬的一年生或越年生草本植物，是我國最重要的油料作物，也是世界四大油料作物之一[1]，我國油菜的種植面積以及產量均占全世界油菜的30%左右[2]。油菜的生長周期較長，需要對抗的病害種類較多，以油菜菌核病、病毒病[3]、白銹病、黑斑病等為重要病害[4]，導致油菜減產最嚴重的是油菜菌核病。油菜菌核病是由油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape）感染引發的一類子囊菌寄生型病害[5]，其危害導致的減產量占總危害減產量的80%。

目前，油菜菌核病的防治方法主要是化學防治，會對環境產生嚴重污染，在這種形勢下生物防治成為當前對油菜菌核病防治的主要途徑。生物防治主要是利用微生物本身或其次級代謝產物抑制核盤菌的生長，內生細菌作為一種非常重要的微生物資源，近些年來逐漸成為微生物資源研究的重點之一。

目前對油菜菌核病的研究較多，但未見從油菜中分離出內生細菌以篩選菌核病拮抗菌的報道。本研究從甘藍型油菜湘油15的根莖葉中分離內生細菌并進行抗菌活性篩選鑒定，對菌核病拮抗菌的抗菌物質進行初步研究，以期為開發新型防治菌核病的防治藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試內生細菌 樣品采集于湖南農業大學試驗基地，油菜品種為甘藍型油菜湘油15，種植150 d時進行采樣，隨機選取3株作為樣品，采集根莖葉，于4 h內進行消毒滅菌處理。

1.1.2 供試敏感指示菌和病原菌 6種供試敏感指示菌分別為大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 128、變形桿菌（Proteus vulgaris）ATCC 8427、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 6051、藤黃八疊球菌（Sarcinalutea）GC-MCC 1.880、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25922、黑曲霉（Asperillus niger）NCPC 1003，病原菌為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜內生細菌的分離 用自來水將樣品洗凈，吸干水分后稱取根莖葉各5 g進行消毒滅菌處理。無菌研缽研磨[6]，制成0.100 0%、0.010 0%、0.001 0%、0.000 1%稀釋液，各取200 μL涂布肉湯瓊脂培養基（LBA）、營養瓊脂培養基（NA）、牛肉膏-蛋白胨培養基（牛）、10%莖桿汁特殊因子培養基（T），3個重復，取最后1次沖洗的無菌水涂布平板作為對照。培養2～3 d，挑取單菌落并編號，在對應的分離培養基培養皿上采取三區劃線法進行純化3～4次。

1.2.2 內生細菌的系統發育分析 根據菌落形態、大小、顏色等特征，對分離的內生細菌進行比較分析歸類，利用基于16S rRNA基因序列的系統發育分析法和蛋白酶K法，對差異較大的內生細菌進行系統發育分析。擴增反應引物為正向引物16S8F（5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和反向引物16S1506R（5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反應體系（50 μL）：2×Taq Master Mix（Mg2+）25 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增條件為94 ℃預變性2 min;94 ℃ 變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環;72 ℃延伸2 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序，將序列結果提交GenBank注冊得到序列號，在NCBI數據庫中進行在線相似序列比對，保存相似性較高的已知序列到本地txt文本，運用Clustal X[7]和MEGA 6.0[8]構建進化樹。

1.2.3 活性菌株的篩選及其生物學特征 以大腸桿菌ATCC128、變形桿菌ATCC8427、枯草芽孢桿菌ATCC6051、藤黃八疊球菌GC-MCC1.880、金黃色葡萄球菌ATCC25922、黑曲霉NCPC1003作為供試敏感菌株，采用瓊脂擴散法[9]，挑取單菌落接種于裝有50 mL液體LB培養基的150 mL錐形瓶中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養2 d，發酵液 9 500 r/min 離心10 min，直徑為6 mm的2層濾紙片沾取上清進行抗菌活性篩選，待濾紙片周圍出現明顯透明圈時記錄抗菌圈直徑，確定活性菌株。利用革蘭氏染色和芽孢染色對活性菌株進行形態觀察，以6個溫度梯度、6個pH值梯度、5個鹽濃度梯度等指標對活性菌株進行生長情況測定，培養基中加入可溶性淀粉和吐溫-20測定菌株產胞外酶特性。

1.2.4 拮抗菌株的篩選 采用平板對峙法，取邊長為 0.5 cm 正方形病原菌塊接于PDA平板中央，將“1.2.3”中篩選得到的活性菌株等距接于病原菌塊四周，每個菌株3組重復，不接待測菌株只接病原菌株的平板作為空白對照，28 ℃培養。待空白對照組的病原菌長滿整個平板后觀察試驗組病原菌生長情況，確定拮抗菌株。

1.2.5 拮抗菌株對病原菌絲的影響 蓋玻片洗凈，75%乙醇浸泡5 min后晾干，傾斜插于拮抗菌與病原菌中間，待受到抑制作用的病原菌絲長到蓋玻片上時取出鏡鑒。

1.2.6 拮抗物質的初步鑒定及耐熱性分析 選取生長1 d的幼齡拮抗菌株，接種于裝有50 mL液體發酵培養基的 150 mL 錐形瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩培養2 d，發酵液 9 500 r/min 離心10 min，轉移40 mL上清入新的離心管，每管加入20 g硫酸銨，全部溶解后在4 ℃冰箱中過夜，9 500 r/min離心30 min，去上清留沉淀，2 mL無菌水溶解，0.22 μm 過濾器過濾除菌體，得到蛋白粗提物[10]，測定其抗菌活性。將蛋白粗提物置于95 ℃中水浴30 min，測定其抗菌活性。

2 結果與分析

2.1 油菜內生細菌的分離

將甘藍型油菜湘油15根莖葉的研磨液接種到4種培養基上，觀察分析統計結果。由表1可知，從LBA培養基上分離得到26株內生細菌，從NA培養基上分離得到6株內生細菌，從牛肉膏蛋白胨培養基上分離得到13株內生細菌，從T培養基上分離得到23株內生細菌，共分離出68株細菌。其中LBA、T這2種培養基的分離效果最好，分別為26、23株，分別占總分離菌株的38.24%、33.82%。

2.2 內生細菌的系統發育分析

根據菌落形態、大小、顏色等特征，對68株內生細菌進行比較去冗余，最后選取差異較大的18株代表性內生細菌，對其進行基于16S rRNA基因序列的系統發育分析，結果見表2：18株內生細菌屬于細菌域（Bacteria）的2個門[厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）]的3個科[芽孢桿菌科（Bacillaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）]，4個屬：芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、拉恩氏菌屬（Rahnella）和埃希氏菌屬（Escherichia）。其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬占絕對優勢，菌株數分別占測序菌株的44.44%（8株）和38.89%（7株），說明芽孢桿菌和假單胞菌是油菜內生細菌中的常見細菌。其次是拉恩氏菌屬2株和埃希氏菌屬1株，顯示了油菜內生細菌較高的類群多樣性。

2.3 活性菌株的篩選及其生物學特征

由表3可知，用瓊脂擴散法對分離的68株內生菌進行抗菌活性篩選，發現有7株菌株（Y171004、Y172014、Y173005、Y174007、Y174017、Y177001、Y177002）的發酵液至少對1種指示菌具有較強的抗菌活性。其中Y171004對4種指示菌有

抗菌活性;除了Y173005外，其他6株菌株均能抑制革蘭氏陽性菌株金黃色葡萄球菌的生長，表明植物組織中含有非常豐富且有待開發的產活性物質菌株，是微生物資源的一大寶庫。

以6個溫度梯度對7株活性菌株進行生長情況測定。由表4可知，大部分菌株均能在25～40 ℃之間生長，菌株Y177001和菌株Y177002在25～50 ℃之間生長良好，具有較廣的生長溫度范圍且具有耐高溫的特性。菌株Y174007不能在弱酸性環境、無鹽、高鹽環境下生長，其他6株菌均能在pH值為5～10之間、鹽濃度為0～2%之間生長;菌株Y177001和菌株Y177002在鹽濃度為0～7%環境下均能生長，具有較廣的生長鹽度范圍和一定的嗜鹽性。

以Stackebrandt等提出的16S rRNA基因序列相似性小于97%的菌株屬于不同物種的論點為基本原則[11]，并與各類群（科、屬）已知物種進行對比分析，在系統發育分析結果的基礎上，初步確定試驗菌株的物種歸屬。結果表明，18株分離菌株可以歸為14個不同的物種，且大多數分離菌株與其系統發育關系最為密切的已知物種的典型菌株間存在著一定的遺傳差異（序列相似性1株100%，其他98.31%～99.93%）。這些結果表明分離的油菜內生細菌的物種多樣性和遺傳多樣性較高。

選取7株活性菌株中形態差異較大的5株進行培養特征觀察，結果如圖1所示。菌株Y171004、Y172014、Y173005、Y174017和Y177002均能在LBA培養基上生長良好，均用平板對峙法測定內生細菌對核盤菌的拮抗作用。由圖2可知，菌株Y171004和菌株Y177002對核盤菌菌絲的生長有抑制作用，能形成較為明顯的抗菌圈。分析測量結果，菌株Y171004對核盤菌的抗菌圈平均直徑為11.5 mm，菌株Y177002對核盤菌的抗菌圈平均直徑為19.0 mm，且抗菌圈周圍的菌絲顏色變深。繼續培養2 d后觀察發現，菌株Y171004對核盤菌的抗菌圈依舊存在，但是對匍匐菌絲的抑制能力逐漸減弱，匍匐菌絲緩慢生長蓋過Y171004菌體，菌株Y177002對核盤菌的抗菌圈大小沒有明顯變化。

2.5 拮抗菌株對病原菌絲的影響

用埋片法檢測菌株Y171004、Y177002對病原菌絲的影響。由圖3可知，被Y171004菌株分泌物處理過的病原菌菌絲表現出菌絲皺縮，從培養基上肉眼觀察發現抗菌圈周圍的菌絲較疏松。被菌株Y177002分泌物處理過的病原菌菌絲表現出菌絲膨大變粗且變黑，從培養基上肉眼觀察發現抗菌圈周圍的菌絲變黑或變褐。

2.6 拮抗物質的初步鑒定及耐熱性分析

菌株Y171004和Y177002發酵液的蛋白粗提物對病原菌生長的影響如圖4所示。菌株Y171004的蛋白粗提物對病原菌具有抑制作用，并且抑制效果比平板對峙法的抑制效果明顯。而菌株Y177002的蛋白粗提物對病原菌沒有抑制作用，說明其抗菌成分為非蛋白類物質。

菌株Y171004的發酵液蛋白粗提物經95 ℃水浴30 min后對病原菌生長的影響如圖5所示。菌株Y171004的蛋白粗提物經水浴處理后對病原菌沒有抗菌作用。確定菌株Y171004的拮抗物質為不具耐熱性的蛋白類物質。3 結論與討論

本研究從湖南農業大學試驗基地采集的油菜根莖葉中分離出68株內生細菌，比較菌落的形態、大小、顏色等特征，最后選取差異較大的18株內生細菌進行系統發育分析。18株內生細菌屬于細菌域的2個門的3個科的4個屬：芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、拉恩氏菌屬和埃希氏菌屬。其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬占絕對優勢，菌株數分別占測序菌株的

44.44%（8株）和38.89%（7株），說明芽孢桿菌和假單胞菌是油菜內生細菌中的常見細菌。其次是拉恩氏菌屬2株和埃希氏菌屬1株，顯示了油菜內生細菌較高的類群多樣性。

篩選出7株具有抗菌活性的菌株，經16S rRNA系統發育分析和菌株生理生化研究，初步鑒定菌株Y171004、Y172014、Y174007、Y177001、Y177002為芽孢桿菌屬;菌株Y173005為假單胞菌屬，菌株Y174017為腸桿菌屬。菌株Y177001和菌株Y177002能在25～50 ℃之間生長良好，并且在鹽濃度為 0～7%的環境下均能生長，具有較廣的生長鹽度范圍和較廣的生長溫度范圍，具有耐高溫的特性和一定的嗜鹽性。

其中菌株Y171004和Y177002能不同程度地抑制核盤菌的生長。菌株Y171004的分泌物會引起病原菌絲的皺縮，與申光輝等的研究結果[12]相似。肉眼觀察抗菌圈周圍的菌絲較疏松;菌株Y177002的分泌物會引起病原菌絲膨大、變粗且變黑，與顧彪等研究的結果[13]相似。經硫酸銨沉淀耐熱性分析后確定菌株Y171004的抗菌物質為熱不穩定性蛋白。最終確定抗菌活性部分有待進一步研究。

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