水稻穗型相關性狀的QTLs定位

翟雪 張栩 連光倩

摘要：稻穗大小是決定水稻產量的重要性狀，為了挖掘與穗型相關的基因，為水稻產量遺傳育種研究提供理論基礎和應用價值，以大穗秈稻地方品種寶大粒（BDL）和小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，構建F2代群體，對穗型性狀進行數量性狀座位（QTL）初步分析;根據F2群體定位結果，標記選擇區間雜合體，自交構建F4分離群體，驗證QTL位點。結果表明，在F2群體中共檢測到與5個穗型相關性狀的6個QTLs，分別位于第2、6、7染色體上。二次枝梗數QTL qNSB7和一次枝梗數QTL qNPB7定位于第7染色體的RM542～A83區間，LOD值（表示連鎖可能性的大小）分別為10.84和5.03，分別解釋30.74%和12.34%的表型變異，并且在其相鄰的A85～A28和A83～A85區間分別檢測到每穗穎花數QTL qSNP7和穗長QTL qPL7，LOD值分別為5.31和4.12，表型貢獻率分別為14.80%和11.82%。另外，在第2染色體上檢測到1個穗長QTL qPL2，LOD值為3.76，表型貢獻率為9.12%;在第6染色體上檢測到1個結實率QTL qSSR6，LOD值為4.34，表型貢獻率為11.26%。以qNSB7為目標QTL，在F4分離群體中進行驗證，結果表明，qNSB7仍位于RM542和A83標記之間，LOD值為9.84，解釋了30.74%的表型變異，且其他3個QTLs qSNP7、qPL7和qNPB7都聚集在這317 kb的區間，解釋了17.2%～24.6%的表型變異。由結果可知，qNSB7是1個通過增加二次枝梗數，影響每穗穎花數、一次枝梗數和穗長的一因多效新位點。

關鍵詞：水稻;穗型相關性狀;QTL定位

中圖分類號： S511.03 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0059-05

水稻是最重要的糧食作物，提高水稻產量成為解決未來糧食危機的重要手段，也是水稻育種和生產的主要目標。影響水稻產量的因素很多，而單位面積產量可以被解析為穗數和單穗谷粒質量，后者更具有生產意義。單穗谷粒質量由每穗穎花數、結實率和千粒質量3個因素構成，增加每穗穎花數是最重要的高產育種方向和栽培策略。作為重要的穗部性狀，每穗穎花數與一次枝梗數、二次枝梗數、穗長等性狀密切相關。這些性狀在不同群體和環境中定位的數量性狀座位（QTL）結果有較大的差異，被認為是受多基因控制的數量性狀，且受遺傳背景和環境影響[1]。目前已經定位的有關水稻穗部性狀的QTLs有很多，不均勻地分布于水稻基因組中[2-6]。例如，Luo等利用1套以秈稻高產栽培品種桂朝2號為背景的普通野生稻的漸滲系，檢測到39個穗部性狀的QTLs，包括穗長、一次枝梗數、二次枝梗數、每穗穎花數和小穗密度[7]。大多數控制穗相關性狀的QTLs都集中在同一染色體上，這就解釋了這些性狀之間的顯著相關性。

近年來，一些穗部性狀的QTLs被解析為單一遺傳因子從而得到圖位克隆。Gnla是首個被克隆的水稻穗粒數QTL，Gnla是1個與細胞分裂素氧化酶/脫氫酶高度同源的OsCKX2基因[8]。OsCKX2表達量的降低會引起花序分裂組織中細胞分裂素的積累，從而增加穎花數量，提高產量。DEP1是控制水稻直立穗的基因[9]，突變的DEP1通過促進細胞分裂，使稻穗變密，枝梗數増加，穗粒數增加，而穗頸節長度變短。LAX2[10]/Gnp4[11]編碼1個核蛋白，調控水稻腋生分生組織的形成。LAX2能與LAX1蛋白互作，通過調控穗型疏密程度來影響每穗粒數。OsSPL14是調控水稻株型和穗型的基因[12]，OsSPL14突變后，使水稻分蘗數減少，穗粒數、千粒質量增加。LP（EP3）是大穗基因，編碼1個富含Kelch的F-box蛋白，集中在枝梗原基區域表達，主要調控穗型[13]。PROG1編碼1個由167個氨基酸組成的鋅指轉錄因子，主要在腋芽分裂組織中表達[14]。在水稻的進化過程中，PROG1功能喪失，由匍匐生長變成直立生長，株型得到改良，而且穗粒數增加，產量大幅度提高。SP1編碼1個可能的多肽轉運蛋白（PTR），是控制枝梗延伸、決定穗長的基因[15-16]，突變體（short panicle1，簡稱sp1）稻穗變短。

本研究以大穗大粒秈稻地方品種寶大粒（BDL）和小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，通過構建F2群體和F4次級分離群體，在第7染色體的RM542和A83區間定位并確認了1個通過增加二次枝梗數，提高每穗穎花數，同時影響一次枝梗數、穗長的一因多效QTL，為后續進行精細定位、克隆和機制的研究提供重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究材料以大穗秈稻品種寶大粒（BDL）、小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，雜交獲得F1代，F1代自交獲得F2代分離群體（182個單株），用于QTL的初定位。根據F2代結果，標記選擇目標QTL區間雜合型F2代，種植鑒定F2 ∶ 3家系（60株）。在目標性狀分離、其他農藝性狀相對一致的F2 ∶ 3家系中，再次選擇區間雜合體，種植F3 ∶ 4次級分離群體，用于驗證定位結果。2015年種植F2群體，2016年種植F3群體，2017年種植F4群體，以上群體都種植于南京農業大學江浦試驗站，單株栽插，株距16.7 cm，行距20.0 cm，按照田間常規方法進行種植管理。

1.2 性狀調查

在完熟期對應DNA取樣編號進行取樣，每株收取3個較大的稻穗（邊行和邊株不取樣），裝入紙袋，于室內調查穗長、一次枝梗數、二次枝梗數、每穗穎花數和結實率，將3穗平均值作為該植株表型值。取穗頸節至穗頂（不含芒）的距離為穗長（精確至0.1 cm），隨后依次調查一次枝梗數、二次枝梗數、每穗穎花數和結實率。穗部性狀調查后，將同一單株的種子裝回紙袋，曬干，以備后代種植。

1.3 DNA提取和PCR擴增

在移栽定苗后的分蘗盛期，按田間材料、行、株編號，采集各單株的幼嫩葉片，同時采集親本葉片，用于提取總DNA。DNA的提取采用Dellaporta等提出的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取方法[17]。

PCR反應體系：采用10 μL體系，含有1 μL DNA（20 ng/μL），各0.5 μL正反向引物（10 μmol/L），0.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL 10×Buffer（含Mg2+），0.1 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），6.7 μL ddH2O。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，32個循環;72 ℃ 10 min;10 ℃保存。PCR產物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行檢測，銀染顯色，讀帶，用數碼相機拍照并記錄試驗結果。

1.4 簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）的引物篩選和InDel標記開發

SSR標記和InDel標記是群體遺傳作圖的標記。SSR標記都是公開的引物（詳見Gramene網站）。InDel標記的設計依據日本晴與93-11水稻基因組序列同一座位上插入和缺失堿基的差異，采用Primer 5軟件或通過RiceVarMap（http：//ricevarmap.ncpgr.cn/）在網上設計引物，經NCBI（美國國立生物技術信息中心）網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證引物序列在水稻基因組中的唯一性。標記的物理位置參照日本晴基因組序列。SSR引物和InDel引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。涉及QTL位點的InDel標記引物序列見表1。

1.5 QTL分析

用SSR引物和InDel引物對親本寶大粒與矮格拉的多態性進行篩選，選取具有多態性且條帶清晰、易于區分的引物作為候選引物，用于后續使用。用NCBI的Primer-BLAST對候選引物進行物理距離查詢。然后對候選引物進行表型和標記基因型關聯分析，并根據分子標記所顯示的基因型，結合群體表型，采用軟件QTL IciMapping 3.30的Mapping和Bipping功能進行遺傳連鎖圖譜的構建和QTL定位。采用完備加性區間的方法，以LOD值（表示連鎖可能性的大小）>3.0作為QTL存在的閾值，運算1 000次。

2 結果與分析

2.1 穗型性狀表型的鑒定

親本寶大粒（BDL）和矮格拉（AGL）的穗型差異極大（圖1-A、圖1-B）。寶大粒是一個大穗型品種，其穗長為（29.3±3.7） cm，一次枝梗數為（15.3±0.9）個，二次枝梗數多達（40.3±3.7）個，每穗穎花數為（230.4±9.6）粒，結實率為（78.0±2.0）%。相反，矮格拉是一個小穗型品種，其穗長僅為（14.2±1.2） cm，一次枝梗數為（5.8±0.8）個，二次枝梗數為（4.7±1.0）個，每穗穎花數為（40.2±3.7）粒，結實率為（91.1±1.0）%。由圖1-C、表2可以看出，F2群體的穗部性狀中，穗長、一次枝梗數、二次枝梗數、每穗穎花數和結實率在F2群體的變異幅度分別為13.7～39.1 cm，0.7～18.7個，1.7～51.0個，36.2～270.7粒，2.70%～98.46%，說明這5個性狀在F2群體中分離明顯，但均呈正態連續分布（圖2），符合典型的數量性狀特征。

2.2 穗型相關性狀的QTL分析

利用1 300對SSR引物和InDel引物在親本寶大粒與矮格拉之間篩選多態性標記，篩選出共顯性標記150個，多態率僅為11.5%。從中挑選出均勻覆蓋水稻全基因組的90個標記，用于鑒定F2群體（182株）的基因型，構建連鎖圖，分析穗型相關的5個性狀的QTLs。

QTL分析結果顯示，共檢測到穗長（PL）、一次枝梗數（NPB）、二次枝梗數（NSB）、穗粒數（SNP）和結實率（SSR）5個穗型性狀的6個QTLs（表3）。二次枝梗數QTL qNSB7和一次枝梗數QTL qNPB7定位于第7染色體的RM542～A83區間，LOD值分別為10.84和5.03，表型貢獻率分別為30.74%和12.34%，并且在其相鄰的A85～A28和A83～A85區間分別檢測到每穗潁花粒數QTL qSNP7和穗長QTL qPL7，LOD值分別為5.31和4.12，表型貢獻率分別為14.80%和11.82%。即在RM542和A28之間約1 Mb的物理區間內檢測到這4個與穗型相關的QTLs，均表現出正向加性效應，即增效位點來自同一個親本寶大粒。這一結果與表型間高度相關的結果（表4）吻合，說明該區間存在緊密連鎖或一因多效的穗型性狀QTL。

此外，在第2染色體的InDel標記A105和SRR標記RM14001之間檢測到1個穗長QTL qPL2，LOD值為3.76，解釋了9.12%的表型變異。在第6染色體的W45和Y48之間檢測到影響結實率的QTL qSSR6。

2.3 qNSB7位點的驗證

鑒于qNSB7有較大的LOD值和表型貢獻率，且該區間存在其他3個相鄰穗部性狀QTLs，因此將其作為目標QTL作進一步研究。為了避免背景不一致而影響表型鑒定的可靠性，筆者從F2代開始連續利用連鎖標記選擇雜合體自交，建立1個由151個植株組成的F4分離家系（編號為17-6503的家系），對F2定位結果進行驗證。QTL分析顯示，qNSB7仍位于RM542和A83標記之間，LOD值為9.84，解釋了30.74%的表型變異。并且，其他3個穗型QTLs qSNP7、qNPB7和qPL7都聚集在這個區間，解釋了17.2%～24.6%的表型變異（表5）。因此認為，qNSB7在不同世代間可以重演，能穩定遺傳。

以RM542標記為參照，分析該家系不同基因型的二次枝梗數、每穗穎花數、一次枝梗數和穗長的數量分布。二次枝梗數呈正態分布， 矮格拉純合基因型的二次枝梗數分布在 1.0～22.0個范圍內，其平均值為（11.45±5.44）個;寶大粒純合基因型分布在7.3～36.0個范圍內，平均值為（21.61±7.55）個;而雜合體的平均值為（18.45±8.44）個，分布范圍覆蓋了雙親基因型范圍，說明qNSB7是1個半顯性QTL（圖3）。每穗穎花數呈相似的分布特征，矮格拉純合基因型分布在 34.0～136.5粒范圍內，平均值為（89.95±28.01）粒;寶大粒純合型分布在66.0～181.7粒范圍內，其平均值為（124.18±30.15）粒;雜合體的平均值為（110.10±39.26）粒，分布范圍覆蓋了雙親基因型。一次枝梗數、穗長的分布特征類似于上述性狀。因此可以確認qNSB7的定位區間。由于2種純合型的表型值相互重疊，難以從個體表型值定性判斷基因型。盡管在這151個植株中有5個重組型個體，但是仍需要后代群體的平均表型值和變異度來確定基因型。

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