蘇姜豬組織中SIRT2基因表達(dá)分布研究

王利紅 張偉 陳章言

摘要：SIRT2作為第三類去乙酰化酶Sirtuins家族一員，通過催化不同的底物去乙酰化參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、基因沉默等許多生物學(xué)過程。在蘇姜豬14個(gè)組織樣中均檢測到SIRT2 mRNA的表達(dá)，其中在心臟、肌肉、肝臟和脂肪組織中的表達(dá)較豐富;SIRT2免疫陽性細(xì)胞主要分布于肌細(xì)胞、黏膜層細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，表明SIRT2在蘇姜豬組織中的表達(dá)具有廣泛性，且是許多生物學(xué)過程的重要參與因素之一。

關(guān)鍵詞：SIRT2基因;蘇姜豬;組織表達(dá)譜;免疫組化

中圖分類號： S828.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0055-04

SIRT2（silent mating type information regulation 2 homolog 2）是Sirtuins蛋白家族的一個(gè)成員，在動(dòng)物組織中分布廣泛，通過催化不同的底物去乙酰化參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、基因沉默等許多生物學(xué)過程[1-2]。在體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制SIRT2基因的轉(zhuǎn)錄可以提高HIF1α的乙酰化水平，導(dǎo)致脂肪酸氧化和能量解偶聯(lián)下降，此外，SIRT2還可以去乙酰化作用PEPCK1基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞對葡萄糖濃度變化的應(yīng)答，表明SIRT2在調(diào)控糖脂代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2-3]。截至目前，針對母豬組織中SIRT2表達(dá)定位的研究，特別是蘇姜豬的研究鮮有報(bào)道。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量和免疫組織化學(xué)方法檢測SIRT2在蘇姜豬組織中的表達(dá)分布，不僅豐富了SIRT2在豬各組織功能中的作用機(jī)制，而且對于深入探索SIRT2在蘇姜豬組織中的作用，通過分子育種技術(shù)持續(xù)選育提高蘇姜豬生產(chǎn)性能，提供新的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取飼養(yǎng)管理方式一致的6月齡健康蘇姜豬母豬3頭，進(jìn)行屠宰。屠宰后分別采集心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、皮下脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮共14個(gè)組織樣各2份，一份置于液氮中保存，用于基因提取，另一份用PBS清洗后在4%多聚甲醛中固定24 h，制成石蠟組織切片，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器和試劑 紫外分光光度計(jì)（Beckman公司），Quantstudio多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司），組織脫水機(jī)、包埋機(jī)和切片機(jī)（德國Leica公司）。TrIzol?Plus RNA Purification Kit和SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR，購于Invitrogen公司;RNase-Free DNase Set，購于Qiagen公司;Power SYBR?Green PCR Master Mix，購于Roche公司，Anti-SIRT2 antibody，購于ABCAM公司。

1.2.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Invitrogen公司總RNA提取試劑盒說明書操作，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄按照SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR試劑盒說明操作。反應(yīng)條件為：25 ℃，10 min;50 ℃，30 min;85 ℃，5 min，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中豬SIRT2基因序列（NM_001114271.1）設(shè)計(jì)引物，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進(jìn)行定量PCR引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

1.2.4 Real-Time PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件 Real-Time PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）含Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL、（10 μmol/L）Forward Primer 0.5 μL、（10 μmol/L）Reverse Primer 0.5 μL、cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，1 min，95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s收集熒光40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5 免疫組化 將組織切片置于60 ℃恒溫箱中固定1 h后依次放入二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇，用ddH2O洗滌。抗原修復(fù)后，ddH2O和PBST清洗，3% H2O2-甲醇溶液浸泡，15 min后用PBST浸泡并清洗。之后，用血清封閉切片，一抗4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫1 h后，用PBST浸泡并清洗，加入酶標(biāo)二抗室溫孵育，并用PBST浸泡并清洗，DAB顯色液顯色，中性樹膠封片。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 SIRT2基因的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCT計(jì)算，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 蘇姜豬不同組織中SIRT2 mRNA表達(dá)量分析

采用相對定量法，以β-actin作為內(nèi)參基因，矯正不可控制因素，歸一化起始組織量，并定義心臟組織中的表達(dá)水平為1，以對SIRT2 mRNA在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量。

在蘇姜豬母豬14個(gè)組織中均檢測到SIRT2 mRNA的表達(dá)，由圖1可知，SIRT2 mRNA在心臟組織中的表達(dá)量相對最高，顯著高于其他組織（P<0.05）;在肝臟、背最長肌、腿肌中的表達(dá)量均較豐富，顯著高于除腹脂和肺組織外的其他組織（P<0.05）;在脾、卵巢、輸卵管、子宮組織中的表達(dá)量相對最低。

2.2 蘇姜豬組織中SIRT2表達(dá)定位分析

通過免疫組化檢測，在蘇姜豬的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、皮下脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮共14個(gè)組織樣中均檢測到SIRT2免疫陽性細(xì)胞（圖2）。

通過免疫組化檢測，SIRT2免疫陽性顆粒主要分布在蘇姜豬心臟、背最長肌和腿肌的肌肉組織的肌細(xì)胞質(zhì)中。其他組織中，SIRT2免疫陽性細(xì)胞除分布于相應(yīng)肌層外，還主要分布于胃組織黏膜層的固有腺層，小腸、大腸、輸卵管、子宮組織的黏膜層，肝臟組織的肝小葉，腎臟組織的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管，肺組織的肺泡上皮層和支氣管的黏膜層，脾臟組織的紅髓，卵巢組織的皮質(zhì)部和卵泡的顆粒層，皮下脂肪的脂肪細(xì)胞中，且均主要分布于各組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論與結(jié)論

SIRT2作為第3類去乙酰化酶Sirtuins家族中的一員，是一種保守的NAD（nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）依賴性去乙酰酶沉默信息調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期、脂肪細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架形成、神經(jīng)系統(tǒng)功能、衰老、氧化應(yīng)激和熱量限制等生命過程中具有重要的調(diào)控作用[2]。在不同組織中，作為去乙酰化酶的SIRT2能與許多不同的因子結(jié)合使其去乙酰化，如Histone、Tubulin、Foxo1、p53、p300、CDC14B等因子，然而，SIRT2也存在被其他因子乙酰化，減弱其乙酰化活性的情況，因此SIRT2在不同組織和生物反應(yīng)過程中發(fā)揮著多樣的作用[4]。豬SIRT2位于第6條染色體，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法，在所采集的蘇姜豬14個(gè)組織樣中均檢測到SIRT2基因mRNA的表達(dá)，這與Jin 等[5]和劉炳婷[2]在豬的許多組織中檢測到SIRT2 mRNA的表達(dá)報(bào)道相同，表明SIRT2在蘇姜豬組織中的表達(dá)也具有廣泛性。

對比各組織器官中SIRT2 mRNA的表達(dá)量差異，在熱量限制的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)大量SIRT2 mRNA存在于白色脂肪組織和腎臟組織中[6]。吳國芳等在小鼠肌肉和心臟組織中檢測到SIRT2 mRNA相對高的表達(dá)量，肝、肺、腎、脂肪中呈中等表達(dá)，脾組織中的表達(dá)最低[7]。桂林生在秦川牛的腎臟、皮下脂肪組織和肺臟中檢測到SIRT2 mRNA呈現(xiàn)高度表達(dá)，而在肌肉、心臟和肝臟中呈現(xiàn)低度表達(dá)[8]。劉炳婷在長白豬的肌肉和脂肪組織中檢測到較豐富的SIRT2 mRNA表達(dá)[2]。本研究在蘇姜豬心臟、肌肉和肝臟組織中檢測到豐富的SIRT2 mRNA表達(dá)，其次為脂肪組織，脾組織中則表達(dá)量相對較低，這一表達(dá)量差異趨勢與吳國芳等的報(bào)道相似。蘇姜豬肌肉和脂肪組織中豐富的SIRT2 mRNA表達(dá)，表明SIRT2基因與蘇姜豬的生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀間存在直接或間接的關(guān)系。

通過定位檢測，發(fā)現(xiàn)SIRT2主要位于細(xì)胞質(zhì)中，與微管共定位，為α-微管蛋白的去乙酰化酶，并在少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程中起著重要的作用[9]，此外，SIRT2還可通過使p65去乙酰化，以調(diào)節(jié)NF-κB依賴性基因的表達(dá)。而在細(xì)胞有絲分裂的G2/M轉(zhuǎn)換期，SIRT2可以瞬間轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，去乙酰化組蛋白H4的16位賴氨酸，降低其乙酰化水平，推遲細(xì)胞從分裂期退出[10-12]。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測蘇姜豬各組織中SIRT2表達(dá)分布，結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相同，SIRT2免疫陽性顆粒主要定位于各組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。Yang等證實(shí)SIRT2能夠通過Nrf2信號通路參與心力衰竭[13]，本研究在蘇姜豬心臟和肌肉組織中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒，且在

實(shí)時(shí)熒光定量檢測中測得相對較高的SIRT2 mRNA表達(dá)量，表明SIRT2對于蘇姜豬心臟及肌肉功能的重要性。除肌細(xì)胞外，SIRT2免疫陽性細(xì)胞還主要分布于蘇姜豬消化系統(tǒng)如胃、小腸、大腸的腺體層和消化腺——肝臟的肝小葉中，表明SIRT2與腺細(xì)胞的分泌功能有關(guān)。

肺是動(dòng)物的呼吸器官，具有呼吸、代謝、防御功能。通過免疫組織化學(xué)檢測方法，在蘇姜豬肺組織的支氣管的上皮層和肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒。細(xì)支氣管的上皮層由纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成;肺泡上皮主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細(xì)胞組成，其中Ⅱ型肺泡細(xì)胞相對最多，具有合成與分泌表面活性物質(zhì)，降低肺泡的表面張力，使肺泡回縮力降低，穩(wěn)定肺泡的形態(tài)，以減少吸氣阻力的作用。蘇姜豬肺支氣管上皮層和肺泡上皮細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)可能與上述細(xì)胞的分泌功能有關(guān)。

Jin等在豬睪丸中檢測到SIRT2 mRNA的高表達(dá)[5]，但有關(guān)SIRT2 mRNA在雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的表達(dá)量情況則鮮見報(bào)道。本研究在蘇姜母豬的生殖系統(tǒng)中，檢測到SIRT2 mRNA的表達(dá)，但表達(dá)量不高。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測，SIRT2免疫陽性細(xì)胞主要分布于卵巢組織的皮質(zhì)部和卵泡的顆粒層，輸卵管和子宮組織的黏膜層，表明SIRT2可能參與卵泡的形成及卵母細(xì)胞的成熟過程，并且與生殖道中細(xì)胞的分泌功能有關(guān)，但在發(fā)情周期不同階段，SIRT2的表達(dá)是否存在規(guī)律性變化，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

腎臟具有動(dòng)物機(jī)體排泄體內(nèi)代謝廢物，以維持體內(nèi)鈉、鉀、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定及酸堿平衡的功能[14]。其中，近曲小管的功能主要是重吸收功能，而遠(yuǎn)曲小管的功能則是繼續(xù)吸收水和鈉離子，并向管腔內(nèi)分泌鉀離子、氫離子和氨，這對維持血液的酸堿平衡有重要作用。本研究在蘇姜豬腎臟組織的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管的上皮細(xì)胞中檢測到豐富的SIRT2免疫陽性顆粒，表明SIRT2與近曲小管和遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞的吸收和分泌功能有關(guān)。

脂肪組織是動(dòng)物重要的代謝器官和內(nèi)分泌器官，調(diào)控著動(dòng)物機(jī)體許多生理和病理過程。在Situins家族的所有蛋白中，SIRT2被認(rèn)為是在脂肪組織中表達(dá)量最高的蛋白[15-16]。在小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞和豬前體脂肪細(xì)胞中，SIRT2基因超表達(dá)可通過去乙酰化FoxO1，促進(jìn)FoxO1與PPARγ的結(jié)合，抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞的分化。在動(dòng)物機(jī)體因?yàn)轲囸I或者能量消耗需要脂類水解供能時(shí)，SIRT2通過對FoxO1的去乙酰化調(diào)控脂類的水解[17]。本研究在蘇姜豬皮下脂肪的脂肪細(xì)胞中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒，且SIRT2 mRNA表達(dá)量較豐富，表明SIRT2基因與蘇姜豬脂肪組織形成有關(guān)。