基于雞卵清蛋白啟動子的納豆激酶慢病毒表達載體表達特性的研究

蔡薇 吳志鵬 趙俊生

摘要：納豆激酶（nattokinase，NK）是一種有效的抗血栓藥物?；谝褬嫿ǖ募{豆激酶慢病毒表達載體，旨在比較其在雞輸卵管上皮細胞和雞胚成纖維細胞中特異性表達的有效性。提取含卵清蛋白啟動子（ovalbumin promoter，OV2）和雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）的pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP重組質粒。通過PCR和雙酶切進行初步鑒定，經生物公司測序、包裝和滴定得轉染傳代培養的雞輸卵管上皮細胞和雞胚成纖維細胞，并采用熒光顯微鏡和qPCR法檢測細胞表達產物。結果表明，載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP構建成功;且熒光顯微鏡下，雞輸卵管上皮細胞的綠色熒光多于成纖維細胞;qPCR檢測發現NK正常表達。提示成功構建納豆激酶慢病毒表達載體且在雞輸卵管上皮細胞中正常表達。

關鍵詞：納豆激酶;卵清蛋白啟動子;雌激素反應元件（ERE）;慢病毒載體;雞輸卵管上皮細胞;雞胚成纖維細胞

中圖分類號：S858.31 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0042-03

臨床上采用注射纖溶酶原激活劑的方法治療血栓和栓塞性疾病。但由于其局限性不能滿足市場需求。而之前所研究的納豆激酶（nattokinase，NK）具有很強的纖溶活性，能直接作用于纖溶蛋白，也能激活體內纖溶酶原[1]，且不具有其他溶栓類藥物的缺點。陳寅等將NK用表達質粒pTYB102轉化大腸桿菌ER2566，測定表達的NK占菌體總蛋白的30%以上[2]。黃志立等研究結果表明NK的表達率為12%，CLT法測定其具有溶栓活性，1 mL菌液的溶栓活性相當于120 U尿激酶[3]。童煜等表達出的1 mg NK干粉的溶栓活性相當于600 U尿激酶[4]。Hofmann等發現在非人類慢病毒轉染人細胞過程中，可能存在轉染效率低等問題[5]。Valori等研究表明，慢病毒（lentivirus，LV）能感染靜止細胞，不會導致寄主細胞死亡，且被它感染的動物細胞能夠連續傳代[6]。Kamihira等通過對慢病毒的改造，極大地增加了慢病毒載體使用的生物安全性[7]。慢病毒載體是以慢病毒基因組為基礎，除去其復制所需的必需基因，以具有治療性的目的基因和選擇性標記物整合構建而成。雞輸卵管生物反應器可使目的蛋白在雞輸卵管中特異性表達，并且隨雞蛋排出體外[8]。卵清蛋白在雞蛋中的比重較大，雞體細胞中的基因組均含有卵清蛋白序列，由多個外顯子和內含子組成，其中一些外顯子是構成mRNA編碼區的重要組件[9]。在糖皮質激素和雌激素等激素的作用下，卵清蛋白基因中的類固醇激素依賴性調控元件SDRE在雞輸卵管細胞中通過激素調節卵清蛋白基因的表達。卵清蛋白基因啟動子序列通過對卵清蛋白基因轉錄活性的調控，對卵清蛋白基因的表達量產生影響[10]。

本試驗通過鑒定、包裝和滴定已構建的納豆激酶慢病毒表達載體，并轉染雞輸卵管上皮細胞和雞胚成纖維細胞以研究其表達特異性，為進一步研制NK轉基因雞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 重組質粒、受精雞蛋和原代雞輸卵管上皮細胞

重組質粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP，由浙江大學動物科學學院動物遺傳育種與繁殖實驗室構建，保存在大腸桿菌菌株DH5a。8～10日齡受精蛋，由浙江大學實驗動物中心提供;原代雞輸卵管上皮細胞，購自上海賽百慷生物技術有限公司。

1.2 主要試劑與工具酶

質粒提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司（TIANGEN，美國）;胎牛血清、DMEM培養液、胰蛋白酶、培養瓶和12孔培養板，均購自斯百匯生物技術（北京）有限公司（Gibco，美國）;SYBR GreenERTM qPCR SuperMix Universal，購自杰英生物科技（北京）有限公司（Invitrogen，美國）。

1.3 納豆激酶慢病毒載體質粒的提取、鑒定、包裝、滴定

根據質粒小提試劑盒（TIANGEN，美國）提取大腸桿菌菌株DH5a內的重組質粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP。采用酶切與測序方法進行鑒定。正確的質粒送上海漢恒生物技術有限公司進行慢病毒包裝，qPCR法測定慢病毒載體滴定。

1.4 細胞的培養

1.4.1 雞胚成纖維細胞的細胞原代培養 取受精蛋中的雞胚，采用1%青-鏈霉素（雙抗）的PBS溶液反復清洗;剪掉雞胚四肢、內臟和頭部。將剩余組織剪碎后貼在培養瓶管壁上，倒置放入CO2培養箱;10 min后再向其中加入5 mL完全培養液;待組織塊完全浸潤后，繼續放入CO2培養箱中培養。

1.4.2 細胞傳代培養 去除培養瓶中原有培養液，采用 37 ℃ PBS溶液漂洗細胞2～3次，再加入2～3 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在培養箱中翻轉消化;待顯微鏡下觀察到細胞回縮變圓分散成單個細胞時加入完全培養液終止消化，按1 ∶ 2的比例分裝成2瓶，放入培養箱中繼續培養。

1.5 納豆激酶基因在細胞中的表達

1.5.1 納豆激酶慢病毒載體轉染 待傳代后的雞輸卵管上皮細胞和雞胚成纖維細胞密度生長至80%左右時，采用納豆激酶慢病毒表達載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP進行轉染，以293F細胞為對照，通過熒光顯微鏡觀察細胞。

1.5.2 NK的mRNA水平檢測 提取雞輸卵管上皮細胞中的總RNA，反轉錄得到cDNA。采用qPCR檢測NK在細胞中的mRNA水平。以GAPDH為內參，cDNA為模板，用Primer 5.0軟件設計并由華大基因公司合成引物。PCR反應體系：SYBRGreenERqPCR SuperMix Universal 12.5 μL，其中 10 μmol/L 引物P1和P2各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC-treated water 11.0 μL。PCR反應條件：90 ℃預變性2 min;95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火1 min，75 ℃延伸10 min，共40個循環。293F細胞為對照組。

1.5.3 數據分析 采用SPSS軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 重組質粒提取、酶切與測序鑒定

由圖1可知，經試劑盒小提質粒其長度約13 kb，重組質粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP進行XmaⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約10.6、2.0 kb的2條亮帶。后者與片段NK-2A-EGFP的大小為2 077 bp相符，與預期結果一致。

2.2 NK的測序和納豆激酶慢病毒載體的包裝、滴定

根據測序結果1 327 bp序列與GenBank公布的序列（GenBank：Ay219901）有99%同源性，可認定NK基因片段已插入表達載體中，成功獲得納豆激酶慢病毒表達載體。qPCR法測定慢病毒載體滴度約為1.6×107 IU/mL。

2.3 雞胚成纖維細胞的培養

雞胚成纖維細胞為貼壁生長型細胞。原代細胞培養1 d，組織塊邊緣開始游離出少量細胞，細胞間隙較大。原代培養2 d，細胞生長密度可以達到70%～80%（圖2-A）。細胞在傳代過程中得到純化，且生長旺盛，形態良好（圖2-B）。

2.4 雞輸卵管上皮細胞的培養

采用組織塊分離法培養16 h得到原代雞輸卵管上皮細胞，此時細胞開始貼壁生長，增殖速度比成纖維細胞慢（圖3-A）。原代培養2 d后，細胞呈梭長形或圓形，生長密度可高達70%左右（圖3-B）。原代培養5 d的輸卵管上皮細胞形態變圓，大多數細胞胞質回縮，雜質增多，細胞生長速度明顯減慢，死亡數增多（圖3-C）。

2.5 轉染后細胞鏡檢

熒光顯微鏡觀察發現，納豆激酶慢病毒載體轉染輸卵管上皮細胞48 h后出現綠色熒光（圖4-B），隨轉染時間的延長，具有綠色熒光的細胞越來越多，到72 h后，達到最高水平（圖4-C）。轉染的成纖維細胞48 h后未發現綠色熒光（圖4-A）。說明OV2在雞輸卵管上皮細胞中特異性表達，初步表明納豆激酶慢病毒載體在輸卵管上皮細胞中成功表達。但與對照組293F細胞相比，雞輸卵管上皮細胞中的綠色熒光量明顯較少（圖5）。可進一步檢測雞輸卵管上皮細胞中NK的mRNA相對表達量。

2.6 NK的mRNA水平檢測

采用qPCR法得到CT值，通過2-ΔΔCT計算出NK的mRNA相對表達量，得出雞輸卵管上皮細胞未感染組與293F細胞對照組差異極顯著（P<0.01），而與雞輸卵管上皮細胞感染組差異不顯著（P>0.05）（圖6），說明納豆激酶慢病毒載體在雞輸卵管上皮細胞中的mRNA表達水平量不高。

3 討論

本次試驗設計了NK目的基因和EGFP報告基因融合在一起插入含卵清蛋白啟動子（ovalbumin promoter，OV2）和雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）的重組質粒pLV-OV2-ERE-EGFP中?，F有的多基因共載體構建策略包括mRNA剪切策略[11]、內部啟動子策略、融合蛋白策略及蛋白酶策略[12]等。這些策略最主要的不足之處在于載體容納能力有限[13]。另外，多基因在同一載體上表達時其蛋白活性及表達效率不及單基因表達載體[14]。2A肽的多基因載體構建策略避免了多基因表達時蛋白活性不高或下游基因表達量低等缺點[15]。Adam等用人角蛋白K14基因的啟動子替換PGK的啟動子（LVK14），后用慢病毒載體感染豬胚胎。盡管在豬所有組織中都檢測到了LVK14的整合體，但是僅在皮膚中有GFP的表達[16]。本試驗轉染雞輸卵管上皮細胞和雞胚成纖維細胞24 h后，前者出現綠色熒光，而后者幾乎沒有。說明啟動子在不同種類的細胞選擇性地執行功能，或是EGFP在不同細胞中差異性地將解，可用Western Blot進行驗證。納豆激酶在雞輸卵管上皮細胞中轉錄的mRNA量較低，表明重組質粒中OV2的效率較低。楊鵬翔等以EGFP和螢火蟲熒光素酶為報告基因，構建OV2慢病毒表達載體，轉染雞輸卵管上皮細胞、雞胚成纖維細胞、鼠3T3-L1 前脂肪細胞和牛乳腺上皮細胞，通過熒光和酶活性檢測發現基于OV2調控序列構建的表達載體無法實現外源基因的高效特異性表達[17]。Ochiai等采用OV2的5′側翼1.35 kb片段和3種不同的病毒啟動子分別構建載體，通過基因槍的方法注射到產蛋母雞的輸卵管部位，結果發現病毒啟動子的啟動效率遠遠高于OV2調控區[18]。這些都與本研究結果一致，驗證OV2在雞輸卵管上皮細胞表達效率低。

參考文獻：

[1]徐 仲，趙曉東，鄭稚鶯，等. 納豆激酶的純化及活力測定[J]. 生物技術，1997，7（4）：16-18.

[2]陳 寅，林旭璦，張志芳，等. 納豆激酶基因在家蠶生物反應器中的表達[J]. 中國蠶業，2003，24（1）：67-68.

[3]黃志立，羅立新，楊汝德，等. 納豆激酶基因重組質粒在大腸桿菌與畢赤酵母中的穩定性[J]. 廣東藥學院學報，2001，17（4）：254-256，259.

[4]童 煜，陳守春，張思仲. 納豆激酶原核表達載體的構建及其活性鑒定[J]. 應用與環境生物學報，2007，13（3）：369-372.

[5]Hofmann A，Zakhartchenko V，Weppert M，et al. Generation of transgenic cattle by lentiviral gene transfer into oocytes[J]. Biology of Reproduction，2004，71（2）：405-409.

[6]Valori C F，Ning K，Wyles M，et al. Development and applications of non-HIV-based lentiviral vectors in neurological disorders[J]. Current Gene Therapy，2008，8（6）：406-418.

[7]張敬之，郭歆冰，謝書陽，等. 用慢病毒載體介導產生綠色熒光蛋白（GFP）轉基因小鼠[J]. 自然科學進展，2006，16（5）：571-577.

[8]Borwompinyo S，Brake J，Mozdziak P E，et al. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells[J]. Poultry Science，2005，84（9）：1477-1482.

[9]Kawabe Y，Kamihira M，Ono K，et al.Production of scFv-Fc fusion protein using genetically manipulated quails[J]. Biosci Bioeng，2006，102：297-303.

[10]杜立新，趙英會，張念華. 雞卵清蛋白基因調控序列指導人促紅細胞生成素轉基因雞的制備[J]. 山東農業大學學報（自然科學版），2004，35（3）：321-324.

[11]Sharma P，Yan F，Doronina V A，et al. A peptides provide distinct solutions to driving stop-carry on translational recoding[J]. Nucleic Acids Research，2002，40（7）：3143-3151.

[12]Kim J H，Lee S R，Li L H，et al. High cleavage efficiency of a 2a peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines，zebrafish and mice[J]. PLoS One，2011，6（4）：185-186.

[13]Trichas G，Begbie J，Srinivas S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice[J]. BMC Biology，2008，6：40.

[14]Provost E，Rhee J，Leach S D. Viral 2a peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos[J]. Genesis，2007，45（10）：625-629.

[15]Kwon M S，Koo B，Choi B，et al. Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein[J]. Biochem and Bioph Res，2004，320（2）：442-448.

[16]Adam S，Cockrell，Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors[J]. Molecular Biotechnology，2007，23（3）：18-23.

[17]楊鵬翔，王曦晨，王宇祥，等. 轉基因雞生物反應器載體的構建及其表達特性分析[J]. 生物工程學報，2011，27（8）：1215-1224.

[18]Ochiai H，Park H M，Nakamura A，et al. Synthesis of human erythropoietin in vivo in the oviduct of laying hens by localized in vivo gene transfer using electroporation[J]. Poultry Science，1998，77（2）：299-302.