相對濕度和培養時間對食線蟲真菌Duddingtonia flagrans產孢量的影響

羅斌漢，潘 紅，岑曼益，趙睿明，孫雨琪，羅千慧，侯俊達，王波波，藺國珍*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130000）

動物寄生蟲病是僅次于傳染病的一大類疫病，由于存在土源性感染，因此在自然放牧的過程中，大部分動物均呈不同程度的感染。然而，目前主要依賴于化學驅蟲藥的使用，來控制動物寄生蟲病的發展。但是，隨著長期大量的使用化學驅蟲藥物，造成了一系列的問題，如化藥殘留、環境污染、耐藥蟲種的出現等[1,2]。因此，人們就去尋找一種能夠補充或替代傳統藥學驅蟲藥，來進一步更好地防治動物寄生蟲。因此，利用食線蟲真菌與寄生線蟲存在的生物拮抗作用，來進一步防控家養動物寄生線蟲病的發展。其中，Duddingtonia flagrans是一種能夠形成捕食器官的食線蟲性真菌，該菌本身在自然界中就作為線蟲的天敵而存在。該菌在生長發育的后期，能夠產生大量的具有雙層厚壁的孢子（厚垣孢子），該孢子不同于其它食線蟲真菌所產生的分生孢子，它們抗逆性極強，能夠通過動物消化道后仍然能保持活性[3-7]。目前D. flagrans作為胃腸道線蟲生物防制的菌種，已在實驗室階段和田間條件下對綿羊、山羊、牛、馬等動物進行了體內通過消化道試驗已經證明對減少糞便中L3的數量是有效的[8,9]。然而，該菌在生長發育的過程中，環境中相對濕度和培養時間對其產孢量的影響至今仍不可知。

本研究的目的是探索該菌株在生長發育的過程中，隨著培養時間的延長及環境中相對濕度對該菌的產孢量的影響，旨在獲得該分離株最大產孢量的條件，為將來該菌株應用于家養動物寄生線蟲生物防治制劑的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌種

食線蟲真菌D. flagrans分離株（SDH035），由西北民族大學蔡葵蒸教授課題組提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存。

1.2 培養基及其制備

水瓊脂培養基（WA）：按照1.5 %～2 %濃度稱取瓊脂粉于三角燒瓶中，加入蒸餾水，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養基，置于4 ℃保存備用。

麩皮瓊脂培養基（WBA）：8%麩皮原液的制備：稱量80 g麩皮，量取1 000 ml蒸餾水，加熱保持微沸狀態 1 h，經6層紗布過濾后，置于2 000 ml量筒內，并補足至1 000 ml，采用保鮮膜封口置于4℃冰箱靜置過夜，吸取上清液，稀釋至所需濃度，再加入1.5%～2 %的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺內完成倒制平板培養基，置于4 ℃保存備用。

麩皮培養液：按照上述方法制備濃度為8%的麩皮原液，稀釋至2%濃度，121 ℃高壓滅菌20 min，置于4 ℃保存備用。

產孢培養基：糧食培養基的總重量為120 g，主要成分是玉米和小麥，其比例是2：1，按照比例稱取小麥和玉米放入500 ml錐形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及適量的蒸餾水，糧食與蒸餾水的比例是1.5：1，用硅膠塞蓋住并用牛皮紙將其瓶口包好，121 ℃高壓滅菌30 min，置于4 ℃保存備用。

1.3 儀器設備

超凈工作臺；恒溫培養箱；恒溫振蕩培養箱（HZP—250 型）；光學顯微鏡（Leica DME 型）；倒置顯微鏡（Leica）；解剖針；錐形瓶；燒杯；研缽；漩渦振蕩儀；高速離心機等。

1.4 厚垣孢子的生產

在超凈工作臺內，用2%玉米粉瓊脂斜面培養基保存的菌株，在無菌環境下挑取少量菌絲，接種于WA平板中，置于28 ℃培養箱中培養6 d結束培養。用滅菌過的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌絲的瓊脂塊，置于2%液體培養基中，每瓶8塊，置于振蕩培養箱中，180 r/ min，相對濕度分別設為35%和85%，28 ℃培養7 d后終止培養。上述培養物置于旋渦震蕩儀中反復振蕩10 min，按5%接種量將菌液接種至產孢培養基內，置于恒溫培養箱中，28 ℃培養分別培養7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d。培養結束后，隨機抽取5 g不同培養時間段的谷粒培養物，然后用0.05%（w）的滅菌Twain-80水將生長在谷粒表面的菌物洗脫下來，用雙層紗布過濾，獲得含有厚垣孢子的菌懸液，用血細胞計數版對其孢子進行計數，最后推算出每克谷粒產生的厚垣孢子數量。

2 結果

表1表明D. flagrans分離株在兩種相對濕度、不同培養時間段的產孢量。從表1可知，在相同的培養時間下，85%的相對濕度所獲得的產孢量顯著高于35%的相對濕度。

圖1顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在35%的相對濕度下，在恒溫培養箱中培養7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量。結果顯示，隨著培養時間的延長，該菌株的產孢量逐漸升高，當培養時間為7～14 d時，產孢量緩慢上升，此后產孢量急速增加，在培養28 d后該菌株的產孢量趨于平緩，培養至49 d時其產孢量達到高峰。

圖2顯示了食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在85%的相對濕度下，在恒溫培養箱中培養7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量變化趨勢。

表1 Duddingtonia flagrans分離株在兩種相對濕度、不同培養時間段的產孢量

圖1 食線蟲真菌Duddingtonia flagrans分離株在不同培養時間段（相對濕度為35%）的產孢量

3 討論

圖2 食線蟲真菌Duddingtonia flagrans分離株在不同培養時間段（相對濕度為85%）的產孢量

本研究通過對食線蟲真菌D. flagrans分離株分別在35%和85%的相對濕度下，在恒溫培養箱中培養7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后獲取其厚垣孢子，并對其產孢量進行計數。研究結果表明，隨著培養時間的延長，該菌株的產孢量逐漸升高，當培養時間為7～14 d時，產孢量緩慢上升，此后產孢量急速增加，在培養28 d后該菌株的產孢量趨于平緩，培養至49 d時其產孢量達到高峰。此外，該分離株分離株分別在35%的相對濕度下，在恒溫培養箱中培養7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所獲得的產孢量均顯著低于85%的相對濕度所獲得的產孢量。說明，該分離株在相對濕度較高的條件下更易于產生厚垣孢子。若在培養的過程中，環境中的相對濕度較低，將會直接影響該菌產生厚垣孢子的產量。