轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的建立

雷水娟， 劉二龍， 盧 麗， 呂英姿， 蔣 湘， 李嘉琪， 夏柔菲江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌008； 黃埔海關(guān)，廣東 廣州5070；廣州海關(guān)， 廣東 廣州506

棉花是一種富含蛋白質(zhì)、油和料纖維的高附加值經(jīng)濟(jì)作物，其含纖維素87%～90%，常作為紡織和服裝的一種重要原料(畢美超，2016)。 2018 年我國棉花種植面積為335.23 萬hm2，全國棉花總產(chǎn)量609.6萬t (國家統(tǒng)計(jì)局，2018)，2017 年我國累計(jì)進(jìn)口棉花115.48 萬t，比2016 年增長29%(搜棉網(wǎng)，2018)。

MON88701 是一種耐受麥草畏和草銨膦2 種除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花品系，由孟山都公司研發(fā)。MON88701 經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)PV-GHHT6997 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Coker 130 棉花研發(fā)而成，其T-DNA 含有dmo 基因盒和bar 基因盒，分別編碼麥草畏單加氧酶和膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植株內(nèi)均為1個(gè)拷貝。 MON88701 最早于2013 年在美國上市，目前在巴西、澳大利、新西蘭、加拿大、哥倫比亞等國家已經(jīng)獲得批準(zhǔn)種植或允許用作食品、飼料原料，但在我國尚未獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)。

2016 年歐盟轉(zhuǎn)基因食物與飼料基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室建立了一種MON88701 品系特異性的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)方法(European Union， 2016)， 但 目 前 國 內(nèi) 尚 未 見MON88701 品系特異性檢測(cè)方法的報(bào)道。 為打破其他國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，完善我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系識(shí)別及定量檢測(cè)技術(shù)體系，保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)，本研究基于MON88701 5′端鄰接區(qū)序列，建立MON88701 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，為相關(guān)部門監(jiān)管轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 供試材料 轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因油菜DP-073496-4、轉(zhuǎn)基因棉花MON88913、轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-30-2、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因玉米BT11、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、非轉(zhuǎn)基因大米和非轉(zhuǎn)基因棉花新陸早51 號(hào)。 供試材料為本實(shí)驗(yàn)室購置保存；棉花內(nèi)源基因棉花乙醇脫氫酶C 基因(AdhC 基因)(Mazzara，et al.，2007)和轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性片段雙基因陽性質(zhì)粒樣品為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 Primex Ex Taq(2×) for qPCR(大連寶生物)；DNA 提取試劑盒(北京天根公司)；終濃度10 μmol·L-1的引物和探針工作液(閃晶生物公司)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀ABI 7500、ABI 7500FAST(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；微滴式數(shù)字PCR 系統(tǒng)QX 200 (美國伯樂公司)；微量分光光度計(jì)nanodrop 2000c(美國Thermo公司)；研磨機(jī)(德國IKA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品基因組DNA 的提取與純化 稱取100 mg 研磨好的樣品，使用基因組DNA 提取試劑盒提取樣品中的基因組DNA，然后采用微量分光光度計(jì)測(cè)定提取基因組DNA 的濃度，最后將已測(cè)定好濃度的DNA 溶液置于-20 ℃條件下備用。

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫所述轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系轉(zhuǎn)入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物和探針通過Primer 5.0 軟件。 然后在NCBI 網(wǎng)站上將設(shè)計(jì)好的引物、探針通過Blast 比對(duì)，確定引物和探針的理論特異性；用棉花內(nèi)源基因AdhC 對(duì)棉花來源樣品DNA 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系退火溫度及引物探針配比的優(yōu)化 采用寶生物酶系混合物推薦的引物探針比，采用不同體積的引物探針進(jìn)行優(yōu)化。

A 組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.5 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)探針MON88701-P 1 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉(zhuǎn)基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 8.3 μL。

B 組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.4 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)探針MON88701-P 0.8 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉(zhuǎn)基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 8.7 μL。

C 組的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25 μL，包括Premix Ex TaqTM12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)引物MON88701-F 和MON88701-R 各0.2 μL，10 μmol·L-1檢測(cè)探針MON88701-P 0.4 μL，34000 拷貝·μL-1DNA 模板(轉(zhuǎn)基因棉花MON88701品系基因組DNA)2 μL 和ddH2O 5.9 μL。

退火溫度分別設(shè)置為58、60 ℃，反應(yīng)程序?yàn)?5℃30 s，95 ℃5 s，58 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)，于58、60℃分別收集熒光信號(hào)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的特異性 提取轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因油菜DP-073496-4、轉(zhuǎn)基因棉花MON88913、轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-30-2、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米BT11、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米NK603、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、非轉(zhuǎn)基因棉花的基因組DNA 為模板，陽性對(duì)照為Adhc-MON88701 質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大米DNA。 通過己建立的轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增， 對(duì)該檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行鑒定。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將提取的Adhc-MON88701 質(zhì)粒DNA 稀釋后用微滴數(shù)字PCR 進(jìn)行定量，然后用TE 緩沖液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34 和17 拷貝·μL-1，進(jìn)行線性范圍測(cè)試、可重復(fù)性測(cè)試和靈敏度檢測(cè)。 上述9 個(gè)濃度DNA 溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度3 個(gè)平行孔。

1.2.6 可重復(fù)性測(cè)試 對(duì)1.2.5 中倍比稀釋的DNA 溶液， 測(cè)定本實(shí)驗(yàn)建立的方法的可重復(fù)性，并統(tǒng)計(jì)分析其標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化

2.1.1 PCR 檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化 該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的多對(duì)引物和探針，是通過分析轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系轉(zhuǎn)入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列(圖1)，然后分析引物與探針的反應(yīng)效率、擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效果，對(duì)引物和探針進(jìn)行篩選，最終選擇MON8870-F/R/P 引物和探針建立轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性檢測(cè)方法，序列見表1。

2.1.2 PCR 反應(yīng)體系退火溫度及引物探針配比優(yōu)化 退火溫度為58 ℃時(shí)(圖2)，從左到右分別為B、A 和C 組的擴(kuò)增曲線，3 組均擴(kuò)增良好，B 組Ct值最小；退火溫度為60 ℃時(shí)(圖3)，從左到右分別為A、B 和C 組的擴(kuò)增曲線，3 組均可有效擴(kuò)增，但Ct 值均比58 ℃時(shí)稍高，所以基于經(jīng)濟(jì)性和擴(kuò)增效率，考慮選擇58 ℃作為退火溫度、B 組引物探針配比為本研究的擴(kuò)增反應(yīng)體系比較合適。

圖1 MON88701 特異性序列Fig.1 Specfic sequence of MON88701

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR 的引物、探針Table 1 Primers and probes for real-time fluorescent PCR

圖2 退火溫度為58 ℃時(shí)的擴(kuò)增圖Fig.2 Amplification plots of A， B and C prime/probe group at 58 ℃

圖3 退火溫度為60 ℃時(shí)的擴(kuò)增圖Fig.3 Amplification plots of A， B and C prime/probe group at 60 ℃

2.2 特異性測(cè)試

采用1.2.4 中14 種樣品的DNA 測(cè)定本實(shí)驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性檢測(cè)方法的特異性，結(jié)果(圖4) 表明：采用轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性引物MON88701-F/R 和探針MON88701-P 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 時(shí)，典型熒光擴(kuò)增曲線的只有陽性樣品Adhc-MON88701，無典型曲線的均為其他農(nóng)作物材料樣品，說明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法特異性良好。

圖4 MON88701 的特異性測(cè)試Fig.4 Specific test of MON88701

2.3 靈敏度測(cè)試

將提取的Adhc-MON88701 質(zhì)粒DNA 溶液分別稀釋至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17 拷貝·μL-1共9 個(gè)濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)(圖5)。9 個(gè)濃度梯度均有典型擴(kuò)增曲線，其最低檢測(cè)拷貝數(shù)為34 拷貝(25 μL 反應(yīng)體系上樣量2 μL)。 擴(kuò)增圖從左至右分別為340000～17 拷貝·μL-1擴(kuò)增曲線。

2.4 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用2.3 中9 個(gè)濃度梯度DNA 作為模板，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，建立轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系的相對(duì)定量分析。 測(cè)試結(jié)果的Ct 值如表2 所示，根據(jù)表2 中的Ct 值數(shù)據(jù)與在34 ～680000 拷貝(25 μL 體系中上樣量為2 μL)范圍內(nèi)9 個(gè)濃度的對(duì)數(shù)值與所得Ct 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6 所示，線性回歸方程為y=-3.48x+ 39.91，R2=0.99，擴(kuò)增效率為94%(介于90% ～110%)，表明本實(shí)驗(yàn)建立的MON88701 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法在模板量34～680000 拷貝范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，擴(kuò)增效率高，符合ENGL(european network of gmo laboratories)相關(guān)要求(Grl-gmff，2009)；在模板量為34～680000 拷貝的線性范圍內(nèi)，其Ct 值的SD 介于0.22～0.62，RSD 介于0.78%～2.90%，表明在線性范圍內(nèi)最低模板量34 拷貝時(shí)，其SD 和RSD 均小于25%，所以確定本實(shí)驗(yàn)的定量檢測(cè)下限為34 拷貝。

圖5 MON88701 的靈敏度測(cè)試Fig.5 Sensitivity test of MON88701

圖6 MON88701 實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of real-time PCR method for MON88701

3 討論

為保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽制度順利實(shí)施，需要建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)方法來對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行有效鑒別(劉二龍等，2015)。 目前各國均研究和發(fā)展了一些基于不同技術(shù)平臺(tái)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，其中以基于核酸基礎(chǔ)上的PCR 方法為主流(吳永彬等，2011)。 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 能對(duì)外源基因插入受體基因組位點(diǎn)的唯一性特征來設(shè)計(jì)引物探針進(jìn)行檢測(cè)(Kluga et al.，2012)，具有特異、快速、高靈敏性和高能量等特點(diǎn)(Anklam et al.，2002)，因此是目前被廣泛認(rèn)可和采用的一種檢測(cè)方法。 目前已有多種轉(zhuǎn)基因作物品系建立了實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，如轉(zhuǎn)Bt 基因大米(吳孝橫等，2009)、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176(李蔥蔥等，2007)、轉(zhuǎn)基因大豆(吳影等，2007)等。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的靈敏度及可重復(fù)性測(cè)試Table 2 Sensitivity and repeatability test of real-time fluorescent PCR method

本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系轉(zhuǎn)入的基因盒5′端與棉花基因組鄰接區(qū)序列來設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和探針，建立轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，最低定量檢測(cè)下限為34 拷貝，其擴(kuò)增效率為94% (介于90% ～110%)，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的SD 和RSD 均符合ENGL 要求，表明該方法具有良好的特異性、高靈敏度和穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于進(jìn)出境口岸、農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管中轉(zhuǎn)基因棉花MON88701 的檢測(cè)。