苦參種子硬實性的組織解剖學分析

崔芬芬，陳 亮，曹亞萍，王勇飛，喬永剛，宋 蕓

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

苦參（Sophora flavescens Ait.）是一種多年生落葉亞灌木或草本的豆科槐屬植物[1]，是常用的傳統中草藥，傳統中藥材以其干燥根入藥，具有清熱、燥濕、殺蟲、利尿等功效[2]；苦參作為一種常用中藥材，在許多國家包括我國、日本、韓國、印度和一些歐洲國家等都廣泛使用[3]，在我國各地均有分布[4]。苦參的主要化學成分為生物堿和黃酮類化合物兩大類[5]，其具有良好的抗菌生物活性[6]、抗血管生成[7]、抗腫瘤[8]、抗炎[9]和酪氨酸酶抑制作用[10]。另外，還對腫瘤細胞具有抑制作用[11]，作為植物殺蟲劑具有良好的效果[12]。

苦參在中藥學和現代醫藥學領域中都具有重要的地位，以往其化學成分和生物堿的分離提純及藥理作用是研究的熱點[13]，但是對其解剖結構方面的研究和認識仍然是不全面的。目前，市場對苦參的需求量日益增加，但野生資源已無法滿足市場需求，因此苦參的人工栽培具有十分廣闊的前景。苦參的人工栽培主要以種子繁殖為主，但苦參種子具有高硬實性、低發芽率，導致苦參幼苗的嚴重短缺，這已成為阻礙苦參規范化、規模化栽培的障礙。

苦參具有硬實性，盡管引入“硬實”這一術語已超過100 a，但關于種子硬實性的研究仍有一定的不完善性和局限性[14]，硬實抑制種子的大規模生產和種植[15]，但目前關于硬實性的研究較少，僅在大豆等少量物種上有研究[16]。硬實性主要是由于種皮的限制引起的，種皮能夠將內部物質與外部環境分隔開來，有利于種子的形態建成以及對于外界不良環境的抵抗，同時種皮也是外界化合物吸收進入種子的第一道屏障[17]。

為探索苦參種子硬實性形成的原因及生長過程中種皮的變化，利用石蠟切片技術從解剖學層面對苦參種子及不同發育時期的種皮解剖結構進行觀察，以研究種子結構及種皮結構的變化，從而為苦參種子硬實性的鑒定與探索硬實性形成的原因提供細胞學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

收集山西和內蒙古共6 份苦參種子，選擇籽粒飽滿無蟲害的苦參種子備用；并取山西太谷的成熟種子及不同生長發育階段的新鮮種子，獲得其種皮備用，取材從開花當天起每周取一次，直至成熟。

1.2 方法

1.2.1 種子硬實率的測定 將經過挑選后的苦參種子每份隨機挑選3 個重復，每個重復50 粒，在室溫條件下浸泡24 h，統計吸脹和未吸脹的種子數量，計算硬實率[18]（未吸水膨脹的種子）。

硬實率＝未吸脹種子數/供試種子數×100% （1）

1.2.2 種子石蠟切片制作方法 試驗采用常規制片技術中最為廣泛的石蠟切片法[19]制作切片。利用FAA 固定液對材料進行固定，抽氣下沉后于4 ℃保存過夜。用蒸餾水多次沖洗，洗去固定液后開始脫水，利用不同濃度梯度的乙醇順濃度梯度進行脫水，并利用番紅O 進行染色。使用體積分數比為1∶1 的無水乙醇與二甲苯的混合液以及二甲苯溶液對材料進行透明，透明后對其進行浸蠟并包埋。然后，使用YD-1508R 輪轉式切片機對包埋好的材料進行切片，切片厚度為8 μm。將切片干燥后利用二甲苯溶液及無水乙醇和二甲苯的混合液對其進行脫蠟、透明，然后利用不同濃度梯度的乙醇溶液逆濃度梯度進行復水，并利用甲苯胺藍再次染色。最后，再次透明后利用封片劑封固。利用光學顯微鏡OLYMPUS BX51 觀察，拍照并記錄。

2 結果與分析

2.1 苦參種子硬實率統計

對6 個種源的苦參種子硬實率進行測定，結果如圖1 所示，苦參種子具有很高的硬實性，6 個種源的硬實率都超過93%，其中，內蒙古赤峰和山西土河坪的硬實率最，均達98.7%；山西太谷的硬實率最低，為93.3%。

2.2 苦參種子的解剖結構特征

2.2.1 種臍的解剖特征 圖2-b 所示為苦參種子的種臍部位，在種臍部位可以觀察到兩側的株柄殘余物及處于中間部位的維管系統。與珠柄殘余物緊密相連的是致密且整齊排列的柵欄組織細胞層。珠柄殘余物木質化后中間凹陷形成的縫隙為苦參種子的臍縫，在臍縫的下方是發達的維管系統，并且在柵欄組織細胞層下方分布有大量的石細胞。

2.2.2 種皮的解剖特征 苦參種子的種皮堅硬且致密。從圖2-c 可以看出，苦參種皮由外至內依次是：角質層、柵欄組織、骨狀石細胞、厚壁細胞及薄壁細胞。處于最外層的是角質層，主要起保護作用，是連續的長帶狀細胞，均勻地分布在種皮的最外層；與角質層緊密相連的是柵欄組織，其有利于物質的進出，由數層細長的長圓柱形細胞組成，排列緊密，呈柵欄狀，與表皮細胞垂直；位于柵欄組織后的是骨狀石細胞，由厚壁組織發育而來，該細胞兩端稍膨大，形成“工”字形，由單層細胞組成，在細胞間存在很大的細胞間隙，主要起機械支持和保護作用；厚壁細胞是由多層呈橫向排列的細胞組成，起支持作用；最后是薄壁細胞，是由一系列較小的不均勻排列的網狀細胞組成。

2.2.3 子葉的解剖特征 圖2-d 所示為苦參橫切面的子葉部分，從圖2-d 可以看出，子葉中的葉肉細胞整齊排列，子葉細胞中含有大量的淀粉粒，其 為種子的萌發提供，重要的營養物質。

2.3 不同發育時期種皮解剖特征的比較

對不同發育時期的種皮進行解剖分析，結果如 圖3 所示，隨著苦參種子的不斷發育，種皮結構也發生了變化，在開花后第2 周，主要以角質層、柵欄組織、厚壁細胞為主，骨狀石細胞還未分化出現；柵欄組織層較薄，規則的長矩形形狀，排列緊密。在開花后第3 周，在柵欄組織下可見一層細胞形態發生變化，由圓形細胞向矩形狀態轉變，且排列變得緊密，骨狀石細胞已開始分化；柵欄組織排列緊密，細胞形態開始變化，形狀變得狹長。在開花后第4 周，已明顯看出骨狀石細胞的形態，細胞伸長，已具有骨狀石細胞的形態；柵欄組織形態進一步細長變化。在接下來的第5 周，骨狀石細胞形態發生變化，開始兩端膨大，形成“工”字。之后隨著種子的發育，骨狀石細胞膨脹成型，細胞間隙增大，柵欄組織密度增加，排列緊密。

從圖4 可以看出，隨著種子的不斷發育，種皮的厚度顯著增加，在開花后第5 周時達到峰值，隨著時間的推移，種子后期逐漸脫水成熟，種皮厚度降低，但逐漸趨于穩定。

由圖5 可知，隨著種子的發育，柵欄組織在種皮中所占的比例顯著增加，在開花后第10 周即成熟時達到最高。

2.4 不同發育時期種臍解剖特征的比較

對不同發育時期的苦參種臍結構進行觀察，結果如圖6 所示，在種子發育的第2 周時，苦參種臍有珠柄殘余物但中間還未形成凹陷，細胞聚積在一起已初現維管系統形態；第3 周時，珠柄殘余物中間形成凹陷，排列致密的柵欄組織與其緊密相連；在第4 周時，種臍已發育完全，珠柄殘余物、維管系統等結構已出現；在之后的發育過程中，種臍結構基本不再發生變化。說明在種子發育早期種臍結構已發育完全。

3 討論

硬實性是一種常見的休眠方式，大部分的豆科植物都有硬實性。本研究對苦參的硬實性檢測后發現，苦參具有很高的硬實性，6 個種源的硬實率高于93%。硬實性主要是由于種皮的不透性造成的，種皮的結構致密，表面有角質層或者蠟質沉積物，從而使得種子表皮不透水。對苦參種子進行石蠟切片后發現，苦參種子與大豆種子結構相似[20]，主要由種皮、種臍及子葉等結構組成，而種臍部位的珠孔與黃柏種子等相同，均由珠柄殘余物等組成[21]。苦參種皮結構復雜，王書運等[22]在1993 年對幾種豆科植物進行研究指出，豆科植物的種皮結構與禾本科相比更為復雜。研究苦參種皮解剖結構后發現，苦參種皮由角質層、柵欄組織、骨狀石細胞、厚壁細胞以及薄壁細胞等組成[23]，種皮結構復雜，具有典型的豆科種皮結構特征。

角質層不透水、不透氣，并且對胚存在機械阻礙作用，降低了種子的發芽率[24]。有一些學者認為，柵欄層是影響硬實的主要因素，如同在其他豆科植物中觀察到的一致[25-27]，野生大豆種皮的柵欄層與栽培型大豆相比更厚[28]。姜華等[29]對田菁種皮結構與其滲透性之間的關系進行研究后發現，限制水分進入種皮的主要屏障是存在于種皮的柵欄層。徐亮等[30]用酸對野生大豆種子進行處理后發現，柵欄層結構基本保持完整以阻礙水分的吸收，說明柵欄層是引起種皮不透水的主要原因。

本研究對不同時期苦參種子的種皮結構進行研究后發現，隨著種子的發育，種皮的厚度不斷增加，柵欄組織在種皮中所占的比例逐漸增加。柵欄組織的結構致密，沒有細胞間隙，從而增加了種皮的硬度，因此柵欄組織對種皮不透性具有重要的作用。角質層和柵欄組織排列非常致密，而骨狀石細胞和厚壁細胞等隨著種子的發育排列較為疏松。所以，苦參種子硬實不透水的主要原因可能是由角質層和柵欄組織造成的，但硬實性具體形成的分子機制還有待進一步研究。