茶葉中咖啡因和兒茶素類物質(zhì)的提取及含量測定

邵建群 李青原 王玉記 張 楓

(首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗教學(xué)中心，北京 100069)

茶葉是人們?nèi)粘Ｏ矚g的飲品之一，茶葉中含有多種天然活性物質(zhì)。茶多酚是茶葉中的主要有效成分，占干質(zhì)量的15%～30%，兒茶素類占其中的60%～80%[1]。主要包括表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。這些兒茶素類物質(zhì)是茶葉的風(fēng)味與保健因子，目前的研究表明，EC、ECG能夠抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增生[2]，酯型兒茶素EGCG 和ECG，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種特性[3-6]。

咖啡因(caffeine，CAF)是茶葉的另一重要有效成分，含量占茶葉物質(zhì)總量的2%～4%[7]。咖啡因具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)新陳代謝、消除疲勞、增加心臟和胃腸道功能的作用。近年來研究顯示可以預(yù)防阿爾茨海默病[8]、早產(chǎn)兒支氣管肺炎[9]，適當(dāng)飲用還可以降低肥胖、糖尿病和腫瘤的發(fā)病危險[10]。因此研究茶葉中咖啡因的含量，可以合理利用茶葉的保健功能。

針對茶葉中某些物質(zhì)的提取有多種方法[11-12]，但能夠?qū)Σ枞~有效成分進(jìn)行同時復(fù)合提取，也就是一次投料得到多種產(chǎn)品，這既可以提高效益，也是對茶葉資源的充分利用。目前國外采用超臨界萃取技術(shù)[13]，我國在這方面的研究還有待加強。由于咖啡因、兒茶素類能溶解到乙醇中，本研究以乙醇為提取溶劑，高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)為檢測手段，通過采用加熱浸提法和超聲波輔助浸提法，對茶葉中的CAF、EGCG、ECG、EC 4種有效成分進(jìn)行了同時提取的工藝對比研究，旨在為茶葉多種有效成分的復(fù)合提取技術(shù)提供一些相應(yīng)的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀( Alliance 2695/2498，美國Waters公司)；色譜柱(AcclaimTM120，美國Thermo scientific公司)；BT25S電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；RCTBS025控溫磁力攪拌器(德國IKA公司)；高速離心機(jī)(日本久保田2420)；UV2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)對照品CAF購自美國Alfa Chemical公司 ；EGCG、ECG、EC購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。甲醇(色譜純，購自美國Fisher公司)，水為雙蒸水。無水乙醇(分析純)購自北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司；36%乙酸(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實驗所用茶葉均為北京市商品市售茶葉。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品儲備溶液

分別精密稱取CAF 50 mg、EGCG 75 mg、ECG 50 mg、EC 15 mg標(biāo)準(zhǔn)對照品，置于50 mL容量瓶，加適量無水乙醇溶解后，稀釋至刻度，搖勻后配制成CAF質(zhì)量濃度為1 mg/mL、EGCG質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL、ECG質(zhì)量濃度為1 mg/mL、EC質(zhì)量濃度為300 μg/mL的儲備液。

1.2.2 茶葉樣品溶液

茶葉樣品用研缽搗碎，準(zhǔn)確稱取茶葉樣品加入到錐形瓶中，采用不同濃度的提取溶劑乙醇，控制不同的提取時間，不同料液比，分別進(jìn)行加熱和超聲波輔助浸提法工藝進(jìn)行提取。把提取所得的茶葉溶液用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，取濾液200 μL，加入流動相800 μL，作為樣品溶液進(jìn)行HPLC測定。

1.3 檢測波長的選擇

圖1 標(biāo)準(zhǔn)對照品CAF、EGCG、ECG和EC的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of CAF,EGCG,ECG and EC standard substance

CAF：caffeine；EGCG：epigallocatechin gallate；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

1.4 色譜條件

色譜柱為C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)；流動相為甲醇∶雙蒸水∶36%乙酸(25 mL∶74 mL∶1 mL)；流速為 1 mL/min；檢測波長為280 nm，柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為10 μL。

2 結(jié)果

2.1 HPLC適應(yīng)性結(jié)果

精密吸取適量稀釋的“1.2.1”項下CAF、EGCG、ECG和EC各對照品儲備液和樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖詳見圖2。EGCG、CAF、EC、ECG的保留時間分別為8.86、10.57、12.08、20.80 min，理論塔板數(shù)均大于8 000。樣品溶液中EGCG、CAF、EC、ECG與相鄰峰的分離度均大于1.5，對稱因子均為1。

2.2 線性關(guān)系結(jié)果

精密吸取適量稀釋的“1.2.1”項下CAF、EGCG、ECG和EC各系列對照品儲備液，按照“1.4”項下色譜條件對各系列分別進(jìn)樣測定。以峰面積y為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，各組分回歸方程及相關(guān)系數(shù)詳見表1，結(jié)果表明該方法在該實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 加熱浸提法

加熱浸提法是傳統(tǒng)的提取工藝，提取條件簡單易行，為防止一些物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提取溫度不宜太高。

圖2 4種EGCG、CAF、EC和ECG標(biāo)準(zhǔn)對照品和茶葉樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of EGCG，CAF，EC and ECG standard substance and tea sample

HPLC：high performance liquid chromatography；EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；EC：epicatechin；ECG：epicatechin gallate.

表1 CAF、EGCG、ECG和EC的線性關(guān)系Tab.1 Linearities of CAF、EGCG、ECG and EC

CAF：caffeine；EGCG：epigallocatechin gallate；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

由于CAF、EGCG、ECG 和EC都能溶于乙醇中，實驗以乙醇溶液為提取溶劑，采用市售綠茶為樣本，把所得提取液按照“1.2.2”以及“1.4”項下色譜條件進(jìn)行處理和測定，通過單因素實驗來考查乙醇的濃度、浸提時間、料液比不同對CAF、EGCG、ECG、EC提取率的影響。

2.3.1 乙醇濃度對提取率的影響

在1 g茶葉中，分別加入體積分?jǐn)?shù)如圖3所示的乙醇溶液各15 mL，控制水浴加熱溫度為85 ℃，在攪拌條件下提取30 min。由圖3的提取率結(jié)果可知，乙醇濃度太高和太低，4種物質(zhì)的提取率都不如乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%75%范圍內(nèi)的高。因此，選擇最佳的乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為65%。

2.3.2 提取時間對提取率的影響

在1 g茶葉中，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液15 mL，控制水浴加熱溫度為85 ℃，在攪拌條件下分別按圖4所示的時間長度進(jìn)行提取。由圖4的提取率結(jié)果可知，加熱浸提時間從30 min開始，提取率緩慢下降。因此，實驗選擇30 min為最佳提取時間。

圖3 不同乙醇濃度的提取率結(jié)果Fig.3 Different concentration of ethanol on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

圖4 不同提取時間的提取率結(jié)果Fig.4 Different extraction time on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.3.3 料液比對提取率的影響

在1 g茶葉中，控制水浴加熱溫度為85 ℃，采用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液提取，按照如圖5所示的料液比(g∶mL)攪拌提取30 min，然后把離心得到的提取液定容到50 mL進(jìn)行測定。由圖5的提取率結(jié)果可知，但當(dāng)料液比從1∶25增大到1∶50時，CAF、ECG、EC提取率增加相對緩慢。由于增大料液比，溶劑的用量大，后續(xù)對溶劑的處理工作量也大。因此，實驗選擇1∶25為較佳的加熱浸提料液比。

圖5 不同料液比的提取率結(jié)果Fig.5 Different ratio of material to solution on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.4 超聲波浸提法

超聲波提取是利用超聲波機(jī)械粉碎和空化作用，加速提取物從茶葉向溶劑擴(kuò)散的速度，增加有效成分的提取率，可避免加熱造成如兒茶素類物質(zhì)的氧化。實驗以乙醇為提取溶劑，采用市售綠茶為樣本，在室溫條件下，以超聲功率為250 W進(jìn)行提取。把所得提取液按照“1.2.2”以及“1.4”項下色譜條件進(jìn)行處理和測定，通過單因素實驗考查乙醇的體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比不同對CAF、EGCG、ECG、EC提取率的影響。

2.4.1 乙醇濃度對提取率的影響

在1 g茶葉中，分別加入體積分?jǐn)?shù)如圖6所示的乙醇溶液各15 mL，室溫下超聲提取60 min。由圖6的提取率結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%75%范圍內(nèi)各物質(zhì)的提取率較高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于85%時，提取率開始顯著降低。故實驗選擇乙醇的提取體積分?jǐn)?shù)為65%。

圖6 不同乙醇濃度的提取率結(jié)果Fig.6 Different concentration of ethanol on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.4.2 超聲時間對提取率的影響

在1 g茶葉中，加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液15 mL，室溫下按如圖7所示的時間長度進(jìn)行超聲提取。由圖7的提取率結(jié)果可知，超聲時間從10 min到60 min，提取率是逐漸增加，但到70 min時有所下降。因此，實驗選擇60 min為最佳超聲浸提時間。

2.4.3 料液比對提取率的影響

在1 g茶葉中，采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液提取，按照如圖8所示的各料液比室溫下超聲提取60 min，然后把提取液定容到50 mL進(jìn)行測定。由圖8提取率結(jié)果可知，隨著料液比的增加，提取率會提高。當(dāng)料液比從1∶25加大到1∶50時，CAF、ECG、EC提取率增加緩慢。因此，實驗選擇1∶25為較佳的超聲浸提料液比。

圖7 不同提取時間的提取率結(jié)果Fig.7 Different extraction time on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

圖8 不同料液比的提取率結(jié)果Fig.8 Different ratio of material to solution on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.5 兩種提取工藝的對比

分別采用篩選出的加熱浸提工藝，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、料液比為1∶25、85 ℃加熱攪拌30 min提取；室溫超聲波浸提工藝，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，料液比為 1∶25、超聲60 min，對市售的8種茶葉中的4種有效成分進(jìn)行復(fù)合提取。由表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可知：兩種提取工藝對同一種茶葉的4種有效成分的提取率數(shù)據(jù)結(jié)果相近，這說明兩種工藝的提取效率相當(dāng)。另外，在實驗所研究的8種茶葉中EGCG、ECG 和EC在紅茶和普洱茶里含量較少。

3 討論

3.1 提取工藝條件的選擇

茶葉中含有多種有效成分，本實驗是研究不同提取工藝，同時復(fù)合提取CAF、EGCG、ECG、EC 這4種有效成分。從加熱和超聲提取工藝來看，較高的浸出率是乙醇提取濃度在50%75%范圍內(nèi)。推斷是因為幾種物質(zhì)在乙醇和水中都有一定的溶解度，但由于它們結(jié)構(gòu)中含有親水和疏水基團(tuán)，所以純粹用水或用乙醇做提取溶劑都不能達(dá)到它們最大的浸出度，而一定比例的醇、水混合是最合適的提取劑，所以實驗選定了65%的乙醇為提取濃度。

表2 8種茶葉樣品中CAF、EGCG、ECG 和EC的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of eight kinds of tea sample on CAF, EGCG, ECG and EC

加熱提取是基于物質(zhì)在加熱情況下溶解度會增大，但加熱溫度不宜太高，提取時間也不能太長，否則會破壞被提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。而室溫下超聲提取對分子結(jié)構(gòu)中一些易氧化的基團(tuán)影響最小。85 ℃加熱提取30 min與室溫超聲60 min的提取效率相當(dāng)。

在料液比研究中，提取溶劑用量加大，對物質(zhì)的提取率會提高。但如果溶劑用量無限增大，提取率不會大幅度增加時，加大溶劑的用量，既增加了成本，也帶來了溶劑回收處理的問題，因而實驗選擇料液比為 1∶25。

3.2 茶葉品種對有效成分的影響

茶葉中表兒茶素EC含量最高，其次依次是EGCG、CAF和ECG。對于兒茶素類EGCG、ECG、EC，在綠茶和花茶中的含量最高，其次是鐵觀音茶葉，含量較低的是紅茶、普洱茶。這可能是由于紅茶、普洱茶是發(fā)酵茶葉[14]，鐵觀音則屬于半發(fā)酵茶葉，綠茶由于沒有經(jīng)過發(fā)酵，EGCG、ECG、EC結(jié)構(gòu)中易氧化的-OH基團(tuán)沒有被破壞，所以含量高。而CAF在幾種類型的茶葉中都有相當(dāng)?shù)暮浚@說明咖啡因不受是否發(fā)酵的影響，分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，由此可知，如果藥用工業(yè)上大量提取兒茶素類物質(zhì)，就應(yīng)從未發(fā)酵過的茶葉中提取。

中國是茶的故鄉(xiāng)，并且具有多種茶葉品種，從茶葉中提取到的物質(zhì)具有廣泛的生物活性[15-16]，同時它們在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用[17-18]。本實驗所進(jìn)行的這些活性成分的復(fù)合提取研究，旨在提高茶葉的最大利用率，降低成本，減少污染及廢棄物，以實現(xiàn)較高的社會和經(jīng)濟(jì)效益，從而促進(jìn)人類的身體健康。

致謝：本論文獲得“基礎(chǔ)與專業(yè)藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(首都醫(yī)科大學(xué))”和“醫(yī)學(xué)化學(xué)與藥學(xué)北京高等學(xué)校示范性校內(nèi)創(chuàng)新實踐基地(首都醫(yī)科大學(xué))”兩大平臺的支持。