芪參顆粒中獐牙菜苷對過量異丙腎上腺素致小鼠心力衰竭的保護作用*

王 青，蘇聰平，張惠敏，羅 慧，焦文超，李 琳，張晶璇，郭淑貞

（1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 100029）

心力衰竭（簡稱心衰）是指由于各種原因導致的心肌結構和功能異常，引起心室收縮功能（射血）和/或舒張功能（充盈）受損的臨床綜合征?！吨袊难懿蟾?017》[1]指出，心衰現患者人數高達450萬，且患病率隨年齡增加上升。隨著中國逐漸步入老齡化社會，心衰防治工作將是中國醫療衛生事業的巨大挑戰。

芪參顆粒以益氣溫陽、活血解毒立法，治療心衰藥效確切。前期研究表明：其清熱解毒藥味可通過改善能量代謝效率治療心衰[2]。金銀花是芪參顆粒中清熱解毒治法的代表性藥物。獐牙菜苷，又名當藥苷，是金銀花中含量最高的環烯醚萜苷類化合物，有可能是芪參顆粒干預心衰的主要活性成分之一。既往獐牙菜苷的藥理研究主要集中在治療關節炎[3]、骨質疏松[4]、糖尿病[5]等。治療心血管疾病的相關報道較少，僅有一篇報道[6]顯示獐牙菜苷可以有效對抗烏頭堿引發的大鼠心律失常，其作用機制與調節細胞自噬有關。

為進一步研究獐牙菜苷治療心衰的藥理活性，本研究采用BATMAN-TCM數據庫對獐牙菜苷治療心衰的作用及靶點進行預測，并采用異丙腎上腺素致心衰小鼠，觀察其干預心衰的藥效，分析起效環節，旨在發現獐牙菜苷干預治療心衰的作用及其機制，進一步闡明芪參顆粒的效應成分及其機制，同時為治療心衰提供新思路和新的候選藥物。

1 材料

1.1 動物 SPF級C57/BL6N小鼠，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號為SCXK（京）2016-0006。飼養于北京中醫藥大學SPF級動物實驗室，恒溫恒濕環境，自由飲水，普通飼料，適應性喂養一周后開始造模給藥。

1.2 試劑 獐牙菜苷由成都普思生物科技有限公司提供（批號：PS0111123）。卡托普利由中美上海施貴寶制藥有限公司（批號：AAQ3404）。鹽酸異丙腎上腺素（ISO）由西格瑪-奧德里奇（上海）貿易有限公司提供（批號：101722747）。鈉鉀ATP酶α1抗體由Abcam（上海）公司提供（貨號：ab7671）。羊抗小鼠IgG-HRP標記抗體由北京拜爾迪生物技術有限公司提供（貨號：DE0602）。RIPA裂解液由北京普利萊基因技術有限公司提供（貨號：C1053）。

1.3 儀器 加拿大Vevo?2100小動物超聲影像平臺，匈牙利3DHIESTECH數字切片掃描系統Pannoramic 250/MIDI，美國Bio-Rad凝膠成像系統Universal Hood II，美國伯樂Bio-Rad小型垂直電泳轉印系統。

1.4 BATMAN-TCM在線生物信息數據庫 本數據庫的網址 http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/。

2 方法

2.1 分組與模型制備 C57/BL6小鼠常規飼養，適應性飼養一周后，隨機分為空白組（8只）、模型組（11只）、卡托普利組（9只）、獐牙菜苷組（9只）。模型組與給藥組采用課題組前期建立的梯度造模法[7]：通過皮下注射過量ISO（第1日20mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg）構建心衰小鼠模型?？ㄍ衅绽M每天給予卡托普利16.5 mg/kg，獐牙菜苷組每天給予獐牙菜苷120 mg/kg[8]，從造模第1天起給藥，給藥14 d?？瞻捉M每日給予等量蒸餾水。

2.2 心功能檢測 實驗終點，采用加拿大Vevo?2100小動物超聲影像平臺評價小鼠心功能。測量左室收縮末內徑（LVIDs）、左室舒張末內徑（LVIDd），計算射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）。每只動物采樣3次，記錄3個連續心動周期的平均值用于后續分析。

2.3 病理學檢測 取材時將心臟置于1%磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗血液，使用數碼相機，拍攝、觀察心臟整體形態。

心臟組織沿中心最大橫徑處切開，心底部浸入4%多聚甲醛固定24 h后，常規乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片貼片，進行蘇木精-伊紅染色（HE）。

2.4 數據庫靶點預測 打開http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，選擇 example 3，輸入“Sweroside”，及該化合物的pubmed CID：161036，確定Score cutoff為20，以P＜0.05為統計學意義范圍進行檢索獐牙菜苷治療心衰疾病靶點。

2.5 Western blot檢測候選靶點 心肌組織液氮速凍，-80℃保存。RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白。上樣量為30 μg，電泳濃縮膠時電壓為80 V，電泳分離膠時，電壓為120 V，電泳1.5 h。電轉采用恒流300 mA，1.5 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°孵育過夜（小鼠單克隆抗體，ATP1A1，1∶5 000），TBS-T 緩沖液漂洗3次，每次10 min；取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF）加入二抗（羊抗小鼠IgG-HRP 標記，1∶5000），室溫孵育1 h，TBS-T緩沖液洗膜3次后，滴加ECL發光液，曝光。記錄每條蛋白泳帶的灰度值，采用Image lab進行定量分析。

2.6 統計學方法 采用SAS8.4統計軟件進行數據分析，所有數據均以均數±標準差表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 小鼠心臟超聲 模型組與空白組相比，EF、FS值顯著降低（P＜0.01），LVIDs值顯著增加（P＜0.01）、LVIDd有所增加（P＜0.05）；與模型組相比，獐牙菜苷可以顯著改善過量ISO致心衰小鼠的EF和FS值（P＜0.01），使 LVIDs顯著降低（P＜0.01），對 LVIDd無顯著影響，該作用與陽性藥卡托普利相近。見圖1。3.2 病理學檢測 剖檢可見，與空白組小鼠相比，模型組小鼠心臟變大，給藥組小鼠心臟與空白組小鼠心臟大小相近（見圖2）。心臟HE染色切片顯微鏡下觀察可見，與空白組小鼠相比，模型組小鼠心臟組織左心室壁變薄，心肌纖維變細，部分動物心臟組織可見心肌纖維壞死、炎細胞浸潤等病理改變；與空白組小鼠相比，卡托普利組和獐牙菜苷組小鼠心臟組織左心室壁厚度基本正常，心肌纖維無明顯變細。見圖3。

3.3 BATMAN-TCM預測靶點 BATMAN-TCM數據庫預測獐牙菜苷治療心衰靶點為ATP1A1（ATPase Na+/K+Transporting Subunit Alpha 1）。

3.4 Western blot結果 與空白組相比，模型組ATP1A1蛋白表達水平顯著下調（P＜0.01）；與模型組相比，獐牙菜苷組ATP1A1表達上升（P＜0.01）。

4 討論

心衰是多種心系疾病的重要轉歸，是各種心臟疾病的嚴重和終末階段。目前西醫多采用抑制神經內分泌激活的黃金三角治療策略[9]，盡管有一定的療效，但不良反應較多，遠未能滿足臨床需求。中醫藥中國的重要寶庫，具有多水平、多層次、多途徑、毒副作用小的起效特點。芪參顆粒治療心衰療效確切，機制研究涉及較廣，但多采用復方整體研究思路[10]，對效應成分的研究還不夠。

圖1 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠EF、FS、LVIDd、LVIDs的影響

圖2 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠心臟大體形態的影響

為進一步揭示芪參顆粒發揮藥效的主要成分，對芪參顆粒有效活性成分進行藥效篩選。獐牙菜苷是芪參顆粒中特色藥有效成分，但目前關于其治療心血管疾病的研究報道較少。故本研究依據BATMAN-TCM數據庫對獐牙菜苷治療心衰的作用靶點進行分類預測和篩選，預測靶點為，即Na+-K+-ATP酶α1亞基（ATP1A1）。三磷酸腺苷酶（NKA酶），是存在于細胞膜上的一種膜蛋白，由α、β、γ 3種亞基組成，α亞基是其中最重要的催化亞基，大小約為 112 kDa，含有 ATP、Na+、K+及強心苷的結合位點[11]。α亞基的表達具有組織特異性和種屬差異性，α1表達最為廣泛，存在于所有細胞中，Na+-K+-ATP酶可利用ATP的水解產生能量，使3個Na+移出細胞，2個 K+移入細胞，確保跨膜 Na+、K+電化學梯度的產生和維持。

實驗結果證明，皮下注射過量ISD可引起模型組小鼠發生心衰。獐牙菜苷可以顯著改善過量ISD引起的心衰，且作用機制與預測靶點ATP1A1有關。心衰發生時，NKA酶α亞基的表達會發生改變，α1亞基具有離子泵與信號調節的功能[12]。目前報道強心苷類藥物的唯一作用靶點是NKA酶，但強心苷類藥物具有藥物治療安全范圍狹窄、容易中毒的缺點。獐牙菜苷可能通過ATP1A1發揮強心作用，一方面有助于揭示中藥復方芪參顆粒起效的物質基礎，另一方面這可能為具有強心作用的藥物研究提供新的候選化合物。開發中醫藥寶庫，挖掘更多活性成分，明確其靶標，有助于中醫藥事業的發展繁榮。

圖3 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠心臟組織病理結果（HE染色，40×）

圖4 Western blot法檢測各組小鼠ATP1A1蛋白表達變化

本研究通過過量ISO構建小鼠心衰模型，運用網絡藥理學方法預測靶點，并在蛋白表達水平進行驗證，表明獐牙菜苷治療心衰的藥效與上調ATP1A1的表達量有關，為獐牙菜苷成為抗心衰藥物的候選藥物奠定了基礎。但獐牙菜苷干預心衰的藥效還需要通過其他動物模型進行驗證。ATP1A1是否為獐牙菜苷的直接作用靶點，ATP1A1的表達量變化是否與獐牙菜苷的抗心衰藥效存在因果關系，都還有待進一步的深入研究。