淫羊藿藥材的UPLC指紋圖譜研究*

尹艷微，賈 琪，馬文娟，歐陽慧子，常艷旭，何 俊

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicomuMaxim.）、箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum（Sieb.Et Zucc.）Maxim.]、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens Maxim.） 或朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai）的干燥葉[1]。具有補腎陽，強筋骨，祛風濕功效[1-3]。其主要化學成分為黃酮類、木質素類等化合物[4-5]，其中黃酮類化合物為其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗心肌缺血和強筋骨等的作用。現代研究表明，淫羊藿具有抗骨質疏松，免疫調節與延緩衰老等藥理作用[6-8]，臨床多用于治療骨質疏松癥、高血壓、血液病等疾病。作為傳統的補益類中藥，淫羊藿藥材具有較高的臨床藥用價值，中國淫羊藿物種資源豐富，應對其進行合理、充分的開發和利用。但是淫羊藿藥材種類多、分布廣，受產地、氣候、生態環境等因素影響，其所含化合物種類及含量差異較大，質量和療效都不可控，嚴重影響了淫羊藿藥材的臨床使用。因此，需要建立快速、可靠的分析檢測方法，以便能夠更加全面、系統的評價淫羊藿藥材的質量。

中藥指紋圖譜是將某種中藥材或中成藥經過適當處理后，采用一定的分析手段，提取其化學信息并加以描述，得到能夠標志該中藥材或中成藥特性的共有峰的圖譜[9]。其顯著特點是整體性強、信息量豐富、特征性強。建立中藥指紋圖譜分析方法有許多種，包括色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜等。中藥指紋圖譜根據圖譜的整體信息，對中藥質量做出整體評價，其目的在于反映中藥多成分特點，整體控制中藥質量，確保中藥內在質量的均一、穩定[10]。根據指紋圖譜技術要求，針對淫羊藿藥材成分復雜、含量差異大及質量參差不齊的現狀，本研究以湖北、吉林、四川、甘肅等12個不同批次的淫羊藿藥材建立淫羊藿的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，為淫羊藿藥材的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有在線脫氣機、四元泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器（DAD）；AX 205型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；3K15型高速離心機（美國Sigma公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試藥 對照品寶藿苷I（批號：AB201B）、朝藿定 A（批號：AP770E）、朝藿定 B（批號：AW850E）、朝藿定 C（批號：AP775E）、木蘭花堿（批號：AP102M）、淫羊藿苷（批號：AB070I）均購自天津一方科技有限公司。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自美國Fisher公司，甲酸（色譜純）購自美國ROE公司。

淫羊藿分別采自于吉林、湖北、甘肅、陜西、四川、遼寧等地，淫羊藿基源由天津中醫藥大學王暉老師鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：CORTECS?C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相：A 相 0.1% 甲酸水，B 相乙腈；梯度洗脫，洗脫梯度為：0～4 min，5%～20%B；4～5 min，20%～25%B；5～10 min，25%～25%B；10～11 min，25%～40%B；11～17 min，40%～48%B；17～18 min，48%～5%B，流速為 0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：1 μL；檢測波長 270 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I對照品各5.00 mg，加甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的儲備液，4℃冰箱儲存備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取不同批次淫羊藿粗粉（過60目篩）50.0 mg，加70%乙醇定容至5 mL，超聲提取1 h，加70%乙醇補足失重，取上清液經0.45 μm有機微孔濾膜過濾即得，4℃冰箱儲存備用。不同批次淫羊藿的產地及基源見表1。

表1 不同批次淫羊藿的產地及基源

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 精密稱取淫羊藿樣品5（湖北）50.0 mg，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按上述的色譜條件連續進樣6次，進樣量為1 μL，測得各共有色譜峰相對保留時間及峰面積，計算其RSD值，結果見表2，表明精密度良好。

表2 淫羊藿指紋圖譜的精密度、穩定性、重復性結果（n=6）

2.3.2 重復性實驗 精密稱取淫羊藿樣品5（湖北）6份，每份50.0 mg，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，進樣量為1 μL，記錄共有成分保留時間及峰面積，計算其RSD值，結果見表2，表明重復性較好。

2.3.3 穩定性實驗 精密稱取淫羊藿樣品5（湖北）50.0 mg，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣 1 μL，記錄共有成分保留時間及峰面積，考察室溫條件下樣品的穩定性，計算其RSD值，結果見表2，表明供試品溶液24 h內穩定。2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析 分別取12個不同批次的淫羊藿藥材，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件分別測定，得到不同批次的淫羊藿藥材UPLC指紋圖譜。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2.0版，國家藥典委員會，2010）對12個不同批次淫羊藿藥材的實驗數據進行分析，以標準指紋圖譜為參照色譜圖，得到12批淫羊藿藥材特征圖譜見圖1。由圖1可知，這12批不同批次淫羊藿藥材有21個共有峰，其中有6個已知峰，依次為木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷I。相似度分析結果見表3。

圖1 12批淫羊藿藥材UPLC指紋圖譜

表3 相似度分析結果

3 討論

淫羊藿作為傳統中藥材并被廣泛使用，其成分復雜，含有黃酮類、木質素類、生物堿類、甾體類等多種化學成分。王麗霞等[11]采用反相液相色譜（RPLC）法，對秦嶺山區產4種淫羊藿藥材進行指紋圖譜研究，并采用LC/MS法標定了朝藿定AI、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷五種化合物。陳婷等[12]采用高效液相色譜（HPLC）法，對同一批次朝鮮淫羊藿藥材樣品進行測定，建立朝鮮淫羊藿HPLC指紋圖譜，標定了4個特征峰，分別為淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C。本研究在前期研究的基礎上，建立了淫羊藿藥材UPLC指紋圖譜，得到不同產地各批次淫羊藿藥材與標準指紋圖譜相似度均在0.911以上。圖譜中有21個共有峰，標定了6個化合物，分別為淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、木蘭花堿和寶藿苷I，可更加全面、快速的對淫羊藿藥材進行質量控制，為今后開展淫羊藿藥材譜效學研究，使其質量和藥效結合奠定了基礎。