百合中王百合苷A 對土壤肥力的響應分析

袁志鷹，夏江南，劉月新，江星明?，陳乃宏，2，4，許光明，周小江，2

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥飲片標準化與功能工程技術中心，湖南 長沙 410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術中心，湖南 長沙 410208；4.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050）

百合為百合科百合屬多年生草本球根植物，株高一般約70～150 cm，鱗莖為其主要藥用部位，由多片肉質肥厚、卵匙形的鱗片聚合而成，具有養心安神、潤肺止咳功效［1-3］。湖南龍山卷丹百合Lilium lancifoliumThunb.種植基地是我國最大的藥用百合種植集中區，是龍山縣的支柱產業［4-5］。卷丹百合含有酚酸、酚酸甘油酯、皂苷等多種活性成分，具有鎮靜催眠、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種藥理活性［6-8］，而課題組前期研究發現王百合苷A 在多批次百合藥材均存在，因此深入研究王百合苷A 非常有意義。

土壤是中藥材種植栽培的基礎，更是其生長發育所需水、熱、氣、肥的供應者。從植物營養學和環境脅迫的角度來說，土壤肥力勢必影響到中藥材的有效成分含有量［9-10］，從而影響到中藥方劑臨床治療效果。而土壤肥力因子種類較多，借助內梅羅綜合指數法將土壤中各肥力因子的影響整合為一個指數［11-13］，可探究土壤肥力與百合藥材主要活性成分的相關性。

本研究通過測試龍山縣百合種植代表性基地土壤的各項肥力指標，參照國家土壤屬性分級標準，運用改進的內梅羅綜合指數法對土壤肥力進行綜合評價，并利用UPLC方法測定對應土壤種植的卷丹百合藥材中王百合苷A 的含有量，探究土壤肥力因子對百合主要化學成分王百合苷A含有量的影響，以期為卷丹百合生產基地的選址及其質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1290 Infinity 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；KM-250DE 中文液晶臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；AA-7000 原子吸收分光光度計（日本島津公司）；TU-1900 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；電爐（北京市永光明醫療儀器廠，功率1 000 W）；FW100 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；AR124CN 電子天平（上海奧豪斯有限公司）；SMART 2 PURE 智能一體化超純水系統（美國賽默飛世爾科技公司）。王百合苷A 對照品（0252-DT01，上海詩丹德公司）。氯化鉀（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈為色譜純（韓國LG 公司）；HCl、H2SO4、NaOH、K2Cr2O7等試劑均為分析純。

1.2 樣品采集 龍山百合種植基地位于湘西，海拔400～1 100 m，年均氣溫15.8 ℃，極端最高氣溫39.5 ℃，極端最低氣溫-6.9 ℃，年平均降雨量1 308.1 mm，年均日照時數1 153.6 h，全年無霜期285 d。2017 年7 月，在野外詳細調查的基礎上，選取5 塊典型田地為研究對象（2 塊必須輪作才能種植百合，3 塊連續3 年連作都能種植百合）。土壤樣品按照“S”型5 點采樣法，采集0～30 cm 土壤，混合均勻，去除植物根系和石塊等，自然風干磨細后，分別過孔徑1 mm 和0.25 mm 篩，裝入保鮮袋備用。

卷丹百合地下鱗莖分別采自對應的研究田地，由湖南中醫藥大學中藥系周小江教授鑒定為百合科百合屬植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.的新鮮鱗莖，洗凈后干燥粉碎，過100 目篩備用。具體見表1。

表1 樣品信息

1.3 土壤測定方法 本研究選擇土壤主要的7 個肥力指標（土壤有機質、全N、全P、全K、有效P、水解性N、速效K）作為研究內容，土壤有機質采用外加熱-重鉻酸鉀容量法（NY／T 1121.6-2006），土壤全N 采用半微量開氏法（NY／T53-1987），土壤全P 采用標準（森林土壤磷的測定LY／1232-2016），土壤全K 采用標準（森林土壤鉀的測定LY／T 1234-2014），土壤有效P 采用標準（NY／T 1121.7-2014），土壤水解性N 采用標準（LY／T 1228-2015），土壤速效K 采用標準（LY／T 1234-2015）進行測定。

1.4 UPLC 測定方法

1.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15.2 min，1%～10% A；15.2～15.5 min，10%～15% A；15.5～17.5 min，15%～25% A；17.5～19.5 min，25%～30% A；19.5～22 min，30%～40% A；22～25 min，40%～75% A；25～27 min，75%～90%A；27～29 min，90%～95%A；29～31 min，95%～1%A）；體積流量0.20 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長308 nm；進樣量2.0 μL。

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g 過100 目篩的藥材粉末，加入30 mL 80%乙醇，靜置1 h，超聲40 min 后過濾，即得。

1.4.3 對照品溶液制備 精密稱取王百合苷A 對照品置于量瓶中，加80% 乙醇溶解稀釋，配制成質量濃度為0.560 mg／mL的溶液，即得。

1.4.4 線性關系考察 精密量取王百合苷A 對照品置于量瓶中，加入80% 乙醇溶解，搖勻，稀釋配成質量濃度為0.5、10、50、100、350、600 μg／mL 的系列標準溶液。在“1.4.1”項條件下進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸。得王百合苷A 回歸方程為Y=0.048 4X+2.568 6（r=0.999 5），在0.5～600 μg／mL 范圍內線性關系良好。

1.4.5 方法學考察 對方法的精密度、穩定性、重復性及加樣回收率考察，結果表明各指標均符合含有量測定要求，加樣回收圖見圖1。

圖1 王百合苷A UPLC 色譜圖

2 結果與分析

2.1 土壤肥力測定 土壤樣品主要肥力指標測定結果見表2。在5 個樣品中，含有量分別為有機質14.3～25.6 g／kg、全氮0.93～1.69 g／kg、全磷0.18～1.14 g／kg、全鉀10.6～26.9 g／kg、有 效 磷7.4～93.8 mg／kg、水 解 性 氮60.3～159.0 mg／kg、速效鉀52.0～259.0 mg／kg。對土壤中有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷、水解性氮、速效鉀變異系數（CV）［14］的分析發現，龍山百合種植土壤中有效磷的變異系數屬于強變異（CV≥90%），由此可知，龍山縣百合栽培土壤中有效磷的含有量差異巨大；全氮、全磷、全鉀、水解性氮、速效鉀均屬于中等強度變異（20% ＜CV＜90%），這幾種成分的含有量在土壤中具有一定的穩定性。有機質含有量變異系數為20%最小，含有量最為穩定。

表2 土壤主要肥力指標及變異系數

2.2 肥力因子等級劃分 根據《全國第二次土壤普查標準》，對龍山百合種植基地土壤養分肥力進行分級，得到樣品土壤中各養分指標的等級，見表3。

表3 土壤樣品養分等級

由表3 可知，基地土壤中有效磷及速效鉀的含有量極高，達到農作物耕地土壤的一二級標準，處于上等水平；有機質、全磷、全氮、水解性氮和全鉀的含有量適中，位于第三等級，處于中等水平。

2.3 綜合評價 土壤肥力采用改進的內梅羅綜合指數法進行綜合評價。主要因子包括有機質、全氮、水解性氮、全磷、有效磷、全鉀和速效鉀。對上述參數進行標準化計算，以消除各參數間差別，處理方法［11］見表4。

表4 土壤肥力等級劃分

其中，Pi稱為分肥力系數，Ci為該屬性測定值。土壤各屬性因子的分級標準（Xa、Xc、Xp）主要參照《全國第二次土壤普查標準》劃分，見表5。

表5 第二次全國土壤普查劃分

采用改進的內梅羅綜合指數法作為評價模型對龍山百合種植基地土壤肥力質量進行綜合評價，計算式［11］為

式中，P為土壤綜合肥力系數，Pi平均值為土壤各屬性分肥力系數的平均值，Pi最小為各分肥力系數中最小值。n為參與評價的土壤屬性個數。最后根據修正的內梅羅公式計算的綜合肥力系數（P）給出土壤的肥力評價，評價標準如下，P≥2.7，很肥沃；P1.8～2.7，肥沃；P0.9～1.8，一般；P＜0.9，貧瘠。見表6。

結果表明，土壤1 與土壤2 綜合肥力系數最低，處于貧瘠水平，與當地藥農采取輪作的方式相符，而土壤3～5的綜合肥力系數相對較高，屬于一般肥力水平，亦與藥農采取連作的栽培方式相符。但總體來看，5 個土壤樣品的綜合肥力系數均低于1.8，值得關注。

表6 土壤綜合評價結果

2.4 土壤肥力因子與王百合苷A 的相關性 分別精密稱取5 份不同采樣點的龍山卷丹百合，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.4.1”項條件下進樣，測定王百合苷A 含有量，每份樣品平行2 次，重復測定2 次，結果見表7，通過SPSS、EXCEL 軟件分析肥力因子與百合主要活性成分王百合苷A 的相關性，擬合方程結果和響應關系圖，見表7、圖2。結果顯示，王百合苷A 和土壤綜合肥力系數呈負相關響應，可用環境脅迫理論［15］來進行解釋。黃璐琦等［16］提出，逆境可能更利于中藥道地性的形成，較差的土壤條件迫使百合中部分次生代謝產物含有量增加以增加對惡劣環境的耐受。

表7 王百合苷A 含有量及土壤肥力相關性

圖2 王百合苷A 含有量與土壤綜合肥力系數響應圖

3 討論

通過對各肥力指標的變異系數和等級劃分可知，龍山百合種植土壤中有效磷的平均水平達到一級肥力標準而其變異系數為90%，屬于強變異，表明該地有效磷含有量豐富但分布不均勻，可能與該地的地表形態與人工施肥不均有關。全氮、全磷、全鉀、水解性氮、速效鉀均屬于中等強度變異，有機質含有量變異系數為20%，屬于低強度變異，表明當地種植土壤有機質分布較為均勻，其中速效鉀的含有量達到二級肥力標準，含有量極高；全磷、全鉀、全氮、水解性氮、有機質含有量處于三級肥力標準，處于中等水平。

本研究對湖南龍山縣卷丹百合種植基地土壤的主要肥力指標綜合性評價研究，結果顯示，龍山縣卷丹百合種植基地土壤肥力處于一般水平；從單個土壤樣品的綜合肥力系數來看，土壤1 與土壤2 綜合肥力系數最低，處于貧瘠水平，與當地藥農采取輪作的方式相符，而土壤3～5 的綜合肥力系數相對較高，屬于一般肥力水平，亦與藥農采取連作的栽培方式相符。因此，中藥材種植與其土壤綜合肥力系數具有高度關聯性，需引起進一步關注。

改良的內梅羅綜合指法計算土壤肥力綜合系數P，并與百合主要成分王百合苷A 的含有量進行SPSS／EXCEL 相關性響應分析。本實驗中選定的5 塊代表性土壤樣品的肥力因子與王百合苷A 呈負相關響應，可能較差的土壤條件迫使百合中主要的次生代謝產物—王百合苷A 含有量增加，以增加對惡劣環境的耐受。