3 種中藥聯合作用對高轉移性乳腺癌模型大鼠炎癥微環境的影響

袁曉英 ，付先蕓，吳田云潔，杜 威，劉 暢，查永久

（1.三峽大學附屬婦女兒童醫院，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443000）

在高轉移性乳腺癌中，免疫細胞分泌的炎癥因子及生長因子形成相互作用的免疫網絡，其導致的慢性炎癥微環境與腫瘤的高轉移密切相關。部分高轉移性乳腺癌因雌激素核受體低表達導致內分泌治療（如三苯氧胺）的低反應性或無反應性，使患者生存率大大下降。對雌激素經典核受體ERα 表達陰性的子宮內膜癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞等［1-2］多項研究證實，藥物干預可以通過影響雌激素膜受體介導快速的非基因型效應而調控腫瘤的增殖及轉移。Walker 256 是一種大鼠源性乳腺癌細胞，作為對化療藥物不敏感的惡性細胞表型［3］，具有高轉移性，通常用于建立乳腺癌腦轉移、骨轉移、肺轉移等［4-5］模型。本實驗運用Walker 256 細胞株建立SD 大鼠高轉移性乳腺癌模型，在臨床實踐及前期研究的基礎上，采用華蟾素片、參一膠囊、血塞通片聯合治療，探討其對雌激素膜受體GPER1 的影響，并以其與腫瘤炎癥微環境的相互作用為研究靶點，尋找治療高轉移性乳腺癌的多靶點作用的可能機制。

1 材料

1.1 動物、細胞 SD 大鼠6～8 周齡共24 只，體質量（120±20）g，雌性，購自湖北省動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2017-0012。Walker 256 細胞株由本校腫瘤實驗室保存，以SD 幼鼠腹水傳代保種，第3 代用于實驗。

1.2 試藥 華蟾素片（干蟾皮提取物，0.3 g／片）購自安徽華潤金蟾藥業股份有限公司出品，國藥準字Z34 020272；參一膠囊（人參皂苷Rg3，10 mg／粒）購自吉林亞泰制藥股份有限公司出品，國藥準字Z20 030044；血塞通片（三七總皂苷，25 mg／片）購自昆藥集團血塞通藥業股份有限公 司，國 藥 準 字 Z53021554。IL-1β 購 于 CST 公 司（12426）；TNF-α 購于ABclonal 公司（A0277）；NGF 購于睿瀛公司（WLT3114）；ERa 購于Santa 公司（SC-7207）；GPER1 試劑購于Abcam 公司（ab39742）；ACTIN 試劑購于賽維爾生物公司（GB13001-1）。

2 方法

2.1 皮下移植瘤模型制作制備 將Walker-256 細胞株懸液注入至SD 幼鼠腹腔內，5 d 后出現腹水體征，形成腹水瘤模型。抽取腹水瘤模型SD 大鼠的米黃色腹水，濃縮細胞密度至2×107／mL；另取8 周齡SD 大鼠24 只，常規消毒左側腋窩皮膚，皮下注射腹水瘤細胞0.3 mL。

2.2 分組、給藥 接種1 周后，將荷瘤大鼠隨機分為空白組、模型組、復方組、西藥組。參考《藥理實驗方法學》中人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值設定給藥劑量。模型組及空白組給予生理鹽水灌胃給藥，4 mL／次，1 次／d，連續給藥7 d；復方組給予華蟾素片、參一膠囊、血塞通片聯合用藥，其中華蟾素片4.8 mg／10 g，參一膠囊0.04 mg／10 g，血塞通片0.3 mg／10 g，配成生理鹽水懸濁液灌胃，4 mL／次，1 次／d，連續給藥7 d；西藥組灌胃來曲唑0.2 mg／kg，配成生理鹽水懸濁液灌胃，4 mL／次，各組1 次／d，連續給藥7 d。

2.3 Western blot 檢測 于末次給藥后24 h，斷頸法處死小鼠，取出乳腺組織標本，Western blot 檢測GPER1、ERα、IL-1β、TNF-α、NGF 蛋 白 表 達。提 取 蛋 白，SDSPAGE 電泳，轉膜，曝光，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，PhotoShop 整理去色，Alpha 軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

2.4 統計學分析 采用SPSS 13.0 統計軟件處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD、SNK 檢驗和Tamhane’s T2 檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、NGF 蛋白表達 與空白組比較，模型組NGF 蛋白表達顯著上調（P＜0.05），而IL-1β、TNF-α 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥復方組NGF 蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、NGF 蛋白表達（±s， n=6）

表1 各組炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、NGF 蛋白表達（±s， n=6）

注：與模型組比較，?P＜0.05

圖1 各組炎癥相關因子、雌激素受體蛋白表達

3.2 雌激素受體ERα、GPER1 蛋白表達 與空白組比較，模型組GPER1 蛋白表達顯著下調（P＜0.01），ERα 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），ERα／GPER1 比值有所上升，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，復方組GPER1 表達顯著上調（P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 各組雌激素受體ERα、GPER1 蛋白表達（±s， n=6）

表2 各組雌激素受體ERα、GPER1 蛋白表達（±s， n=6）

注：與模型組比較，??P＜0.01

3.3 相關性分析 TNF-α 與NGF 蛋白表達呈顯著正相關（P＜0.05），GPER1 與IL-1β 蛋白表達呈顯著負相關（P＜0.05），ERa／GPER1 與IL-1β 蛋白表達呈顯著正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 各指標間相關系數分析

4 討論

4.1 炎癥微環境與高轉移性腫瘤的關系及中藥的治療作用 高度惡性腫瘤細胞因腫瘤生長速度超過了新生血管的生成，導致局部細胞乏氧壞死，同時抗腫瘤治療引發的腫瘤壞死、以及腫瘤自身分泌的生長和趨化因子，均可觸發炎癥應答，招募大量單核免疫細胞進入局部微環境，并將其誘導為腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）。在腫瘤局部微環境中，TAMs 是最豐富的免疫群體［6］，分泌免疫細胞因子及各類生長因子，并形成相互作用的免疫網絡。TAMs 包括M1 和M2 兩個亞型，M1 亞型表達高水平促炎因子，其作用為殺傷病原體，發動抗腫瘤免疫應答，多存在于腫瘤早期。M2 型巨噬細胞具有促進腫瘤生長、抑制腫瘤炎癥反應的作用。有研究發現在乳腺腫瘤中，局部巨噬細胞的數量與腫瘤的惡性程度及預后密切相關，而在高轉移性惡性腫瘤中，巨噬細胞甚至先于惡性腫瘤細胞發生轉移［7］。

在高轉移性腫瘤中，炎癥微環境的存在尤為關鍵。腫瘤轉移發生的必要條件之一為上皮間質轉化（EMT）。大量研究均證實，腫瘤細胞在慢性炎癥的刺激下可激活NFκB 和STAT3 信號通路，通過增強其粘附、運動能力，而發生EMT，為腫瘤轉移奠定基礎；同時，腫瘤細胞聯合TAMs 釋放大量促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6），使炎癥與EMT 之間形成正反饋環路；另外，慢性促炎狀態中的炎癥介質可以增加血管通透性，促進轉移的順利發生。M1巨噬細胞分泌的IL-1β 經研究證實可促進腫瘤的轉移［8］，在鼠基因敲除IL-1β 后消除了黑色素瘤、乳腺腫瘤及前列腺腫瘤的轉移。同時，有研究證實，一定濃度的神經生長因子NGF 對巨噬細胞表現出比較明顯的免疫促進作用，并存在協同效應。本實驗結果亦顯示高轉移性乳腺癌大鼠NGF 顯著上調；IL-1β、TNF-α 表達有上調趨勢。TNF-α 與NGF 表達顯著相關，在大鼠高轉移性乳腺癌模型中，TNFα 與NGF 可能存在免疫協同效應。

現有研究證實，中藥可以調控免疫，改善乏氧炎癥微環境中的細胞因子的異常表達。清熱解毒藥華蟾素可顯著下調肝癌小鼠模型細胞因子IL-6、IL-8 的表達［9］；活血化瘀類中藥三七皂苷R1可下調小鼠缺血心肌局部TNF-α、IL-1β 的濃度［10］；三七、丹參、人參皂苷Rg1可顯著降低關節炎小鼠關節液中IL-1β 和TNF-α 表達［11-12］。本課題組根據癌癥“瘀”“毒”“虛”的病機特點，并通過動物實驗，采用均勻設計法篩選［13］證實華蟾素片（有效成分華蟾素）、參一膠囊（人參皂苷Rg3）、血塞通片（有效成分三七總皂苷）三藥按以一定比例聯合可以有效抑制腫瘤細胞增殖，并在臨床運用三藥聯合取得一定的療效，前期研究已圍繞三藥的協同作用靶點進行了初步探索，結果表明三藥聯合具有抑制高轉移性腫瘤細胞的血管增殖、改善免疫、調控生長因子等多靶點作用［14］，但各靶點間的相互作用機制不清。本實驗結果顯示，經中藥治療后高轉移性乳腺癌大鼠NGF 表達顯著下調；IL-1β、TNF-α 表達有下調趨勢，與現有結論一致，證實促炎微環境的改善是中藥調控高轉移性乳腺癌重要靶點。

4.2 雌激素膜受體對高轉移性乳腺癌炎癥微環境的調控及中藥干預 雌激素受體包括兩大類：一是經典的核受體，包括ERα 和ERβ，它們位于細胞核內，介導雌激素的基因型效應，即通過調節特異性靶基因的轉錄而發揮“基因型”調節效應；二是膜性受體，包括經典核受體的膜性成分以及屬于G 蛋白偶聯受體家族的GPER1（GPR30）、Gaq-ER 和ER-X，它們介導快速的非基因型效應，通過第二信使系統發揮間接的轉錄調控功能。

雌激素膜受體GPER1 對促炎微環境的改善作用在心肌細胞［15］、氣道上皮［16］、血管上皮［17］、神經細胞［18］均得到證實，而采用特異性GPER 基因敲除技術可使雄性小鼠心肌細胞中炎癥反應基因表達增強［19］。

對乳腺細胞的研究中，GPER1 對炎癥微環境的作用存在一定的分歧。部分研究者認為，GPER1 激發乳腺癌細胞及腫瘤相關成纖維細胞的IL-1β 和IL1R1 的表達［8］，導致促炎微環境的發生。而另有研究者從100 例三陰性乳腺癌（TNBC）患者的分析得出GPER1 與腫瘤的分級分期惡性程度負相關，激活GPER1 可以抑制NF-κB／IL-6 ／HIF-1α 及STAT3 炎癥通路［20］。進一步研究顯示，在未分泌經典雌激素受體的乳腺癌細胞SKBR3 中，GPER1 的羧基端作用可阻斷NF-κB 啟動子活性，顯著抑制TNF-α 誘導IL-6 的分泌，當其羧基端突變或缺失時，該作用消失［21］。本課題研究表明，Walker 256 移植后經典受體ERα 表達無顯著差異，而雌激素膜受體GPER1 表達顯著下調，中藥治療GPER1 表達顯著上調，并且GPER1 與促炎因子IL-1β 顯著負相關；ERa／GPER1 與IL-1β 顯著正相關。該實驗結果表明，在高轉移性的Walker 256 乳腺癌模型中，華蟾素片、參一膠囊、血塞通片三藥聯合治療可顯著激活GPER1 表達，并通過介導GPER1 調控腫瘤炎癥微環境。