黃芩苷對高糖致大鼠腹膜組織TRAF6、NF-κB 表達的影響

甘 平，朱丹莉

（貴州醫科大學附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550004）

終末期腎臟病治療方法包括腎臟替代治療（RRT）及腎臟移植，而腎臟替代治療仍是目前治療終末期腎臟病（ESRD）的主要手段。腹膜透析是終末期腎臟病患者腎臟替代療法之一，但長期腹膜透析易導致腹膜纖維化（PF），最終使腹膜超濾失敗，成為腹膜透析患者退出腹膜透析（PD）的主要原因。影響腹膜纖維化的主要原因為反復發生的腹膜炎和生物不相容性因素損傷，如高葡萄糖、高滲、低pH 及葡萄糖降解物。而含葡萄糖的腹膜透析溶液仍然廣泛用于腹膜透析患者。腹膜透析溶液中的高葡萄糖是腹膜炎癥和腹膜纖維化的主要原因之一［1-2］，反復暴露于高糖或其他生物不相容的腹膜透析液中擾亂了腹膜損傷和修復之間的平衡，并導致炎癥、纖維化和腹膜功能損傷。黃芩苷為黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物［3］，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等藥理作用［4-9］。黃芩苷在對肝臟、肺、腎臟及動脈粥樣硬化的抗纖維化作用中起到顯著作用［7，10-13］。還有研究發現，黃芩苷有可能通過其抗氧化作用部分抑制實驗性腹膜纖維化［14］。本實驗觀察黃芩苷對高糖致大鼠腹膜組織TRAF6 與NF-κB 蛋白表達的影響，探討其在腹膜慢性炎癥發病機制中的可能作用。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD 大鼠60 只［動物生產許可證號SCXK（黔）2012-0001］，鼠齡10 周，體質量200～250 g。

1.2 試藥 4.25%腹膜透析液（美國百特公司）。脂多糖（LPS 美國Sigma 公司）；黃芩苷（含有量≥98% 北京索萊寶科技有限公司）。兔抗鼠NF-κB p65 抗體、兔抗鼠α-SMA抗體、兔抗鼠TRAF6 抗體（武漢博士德公司）；HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、免疫組化試劑盒、蛋白質分子量Marker、DAB 顯色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物公司）；蛋白裂解緩沖液（北京天恩澤有限責任公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥 60 只大鼠隨機分為對照組、模型組、黃芩苷組，每組20 只。對照組大鼠每天腹腔注射生理鹽水20 mL；模型組大鼠每天腹腔注射4.25% 葡萄糖腹透液20 mL，在第1、3、5、7 天時注射用4.25%腹透液稀釋為0.6 mg／kg 的脂多糖；黃芩苷組大鼠每天腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液20 mL，在此基礎上灌胃給藥黃芩苷混懸液100 mg／kg，1 次／d，在第1、3、5、7 天注射用4.25%腹透液稀釋為0.6 mg／kg 的脂多糖。常規飼養SD 大鼠，實驗周期為8 周。

2.2 標本取材 于實驗最后1 天給予4.25%腹透液20 mL灌入腹腔后保留4 h，處死所有大鼠，吸取腹腔液，混勻用于白細胞計數；避開穿刺部位，留取壁層腹膜組織10 mm×5 mm×3 mm 大小，4%甲醛溶液固定12 h 以上，另外部分放入-80 ℃冰箱保存，分組做好標記。紅細胞裂解液裂解紅細胞，用改良Neubauer 計數法計數腹腔液白細胞數目，超過3 000／mL 的大鼠為并發感染，退出實驗。

2.3 HE 染色和Masson 染色 取石蠟包埋的壁層腹膜組織，作5 μm 切片，常規方法行HE 和Masson 染色，光鏡下觀察病理改變。

2.4 Western blot 檢測

2.4.1 提取組織蛋白及蛋白定量 取出保存在-80 ℃冰箱中的適量腹膜組織，置于預冷的研缽中混合液氮進行快速研磨，接著將粉末裝入之前預冷好的EP 管中，分別添加細胞裂解液50 μL 后放置冰上20 min。置于4 ℃低溫離心機以10 000 r／min 離心10 min，留取上清液于預冷的EP 管中備用，使用BCA 法進行測定蛋白含量，將剩余蛋白樣品存放于等體積的2×SDS 上樣緩沖液中，沸水煮5 min。

2.4.2 制膠及上樣 制備10%SDS-PAGE 分離膠溶液，混合好后存放于邊條厚度為2 mm 的垂直制膠架上，待膠體呈固態狀時，用吸水紙對膠體進行干燥處理。緩慢注入5%濃縮膠后插入加樣梳，常溫下靜置。使用凝膠電泳儀對處理好的能夠達到實驗標準的凝膠進行垂直固定，添加電泳緩沖液，去除加樣梳，并使用電泳緩沖液對其進行清潔。分別取40 μg 蛋白量的組織總蛋白樣品，加入樣品緩沖液，混合后放置沸水中煮5 min 使蛋白變性。把配置好的樣品溶液放置于濃縮膠的上樣孔內，作為實驗數據收集的對象，向其中加入10 μL 蛋白分子量Marker。

2.4.3 電泳 接通凝膠電泳儀電源，初始電壓設置為80 V。待溴酚藍染料的前緣開始分離膠中上緣后，把電壓提升至100 V，繼續電泳直至溴酚藍泳出分離膠的下緣，此過程中保持電壓輸出穩定。

2.4.4 蛋白質的電轉移和膜封閉 利用半干電轉移儀進行蛋白質的電轉移。電流穩定在30 mA，電轉時間為90 min。轉移結束后，PVDF 膜取出標記膜的方向。接著用5%TBST 脫脂奶粉密封，常溫下進行充分振蕩60 min。

2.4.5 抗原抗體反應及顯影 使用TBS-T 漂洗液對PVDF膜進行清洗，將膜移入雜交袋中，放入適當漂洗液稀釋的抗體，封口，4 ℃孵育過夜；再次用大量TBS-T 漂洗液洗膜，使用新的雜交袋存放PVDF 膜，放入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗；將PVDF 膜置ECL 混合液中于室溫下振蕩溫育5 min。把PVDF 膜片放置在X 光片盒中同時使膜片吸附蛋白面朝上，將X 光片進行感光處理，接著對處理后的膠片進行顯影，待影像清晰后使用水沖洗，待膠片干燥保存，借助IPP 軟件對圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.5 統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行處理，數據以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用Tamhane’s T2（M）檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 實驗動物轉歸 8 周時，60 只大鼠均無死亡，各組大鼠均出現不同程度的活動減少及遲鈍現象，以模型組最為明顯。檢測腹腔液未發現大鼠發生感染。

3.2 大鼠壁層腹膜組織病理學形態 光鏡下對照組大鼠的壁層腹膜可見一層扁平腹膜間皮細胞覆蓋，間皮下基質薄，少許纖維細胞及炎癥細胞；模型組腹膜間皮細胞成柱形、圓形，部分已脫落，腹膜間質中有大量炎癥細胞、成纖維細胞及新生血管浸潤，腹膜結構紊亂，間皮下結締組織厚度明顯增加；黃芩苷干預后，腹膜炎癥細胞及成纖維細胞較模型組明顯減輕，見圖1。

圖1 大鼠壁層腹膜組織病理學形態（HE，×400）

與對照組比較，模型組腹膜間皮細胞下顯示大量膠原纖維沉積，腹膜明顯增厚（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷組腹膜膠原纖維沉積厚度顯著減少（P＜0.05）。見圖2～3。

圖2 大鼠壁層腹膜組織病理學形態（Masson，×400）

3.3 大鼠壁層腹膜組織免疫組化 與對照組比較，模型組增厚的腹膜組織中TRAF6、NF-κB、α-SMA 陽性細胞數目明顯增多，黃芩苷組三者陽性細胞數介于對照組及模型組之間。見圖4～6。

3.4 大鼠壁層腹膜組織TRAF6、NF-κBp65、α-SMA 蛋白表達 與對照組比較，模型組TRAF6、NF-κB p65、α-SMA表達顯著增加（P＜0.05）；黃芩苷作用后，TRAF6、NFκBp65、α-SMA 表達顯著減少（P＜0.05）。見表1、圖7。

圖3 大鼠Masson 染色膠原沉積厚度

4 討論

持續性不臥床腹膜透析（CAPD）是終末期腎臟病（ESRD）患者腎臟替代治療的手段之一。但在持續性不臥床腹膜透析期間，反復接觸生物不相容性PD 液和反復發作的腹膜炎，腹膜不可避免地經歷慢性病理變化，如腹膜間皮細胞柱狀改變及脫落、炎癥細胞及新生血管浸潤、間質纖維化及鈣化等［15］。一般發生在持續性不臥床腹膜透析治療3～4 年以上，且隨時間延長而逐漸惡化。Heimbugerr 等報道腹膜透析患者3 年超濾失敗發生率為9.5%，6 年患者超過30%，Kawaguchi 等［16］報道在日本腹膜透析超過8 年者，超濾失敗達到51%。到目前為止，慢性腹膜纖維化的發生機制尚不清楚，且無有效阻止或延緩其發生的手段。

圖4 大鼠TRAF6 蛋白表達（×400）

圖6 大鼠α-SMA 蛋白表達（×400）

表1 腹膜組織中TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表達（±s， n=20）

表1 腹膜組織中TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表達（±s， n=20）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖7 大鼠壁層腹膜組織TRAF6、NF-κB p65、α-SMA 蛋白表達

TRAF6 是含有C 端TRAF 結構域的TRAF 家族的蛋白質，由卷曲螺旋和高度保守結構域組成［17］，可以通過介導不同的信號通路來調控炎癥反應及細胞凋亡。研究表明，TRAF6 具有控制IKK 和NF-κB 活化的泛素連接酶活性，在經典的NF-κB 激活途徑中，TRAF6 泛素化后與細胞質中的TAK1 ／IKK 激酶形成復合物并被其激活，導致IκBа 的降解，使NF-κB 轉移到細胞核中進行轉錄調控［18-20］。NF-κB作為重要的炎癥因子，其信號轉導參與各種炎癥和免疫應答過程［21］，特別是在腹膜纖維化過程中［22］。最新研究發現［23］，在高糖誘導的腹膜損傷的過程中，NF-κB 的活化部分由TLR4 ／MyD88 信號級聯介導啟動先天免疫應答，引起炎癥并且促進腹膜纖維化的發生和進展。

黃芩苷為一種黃酮類化合物，具有多種生物活性，特別是在調節炎癥、氧化應激、抗纖維化方面，對心血管系統、消化系統、神經系統以及泌尿系統等疾病起到一定的治療作用［4-9］。近年來，研究發現黃芩苷在抗纖維化方面有著顯著作用，有可能抑制細胞因子，如血小板源生長因子-β（PDGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）受體表達促進大鼠抗肝纖維化的作用［10］。Huang X 等［11］研究發現，黃芩苷可能通過增強A2aR 來下調TGF-β1 誘導的ERK1 ／2 信號通路，有效地抑制博萊霉素誘導的特發性肺纖維化（IPF）中的組織病理學和超微結構損傷。最新研究中，黃芩素可能通過抑制磷酸肌醇-3-激酶／Akt（PI3k ／Akt）途徑誘導肌成纖維細胞凋亡來改善腎間質性纖維化［12］。Kitamoto 等發現，sairei-to 主要成分為黃芩苷，有可能通過抑制磷酸二酯酶活性發揮抗氧化作用部分抑制腹膜纖維化［14］。但黃芩苷對抑制腹膜纖維化的相關作用機制尚未完全闡明。在缺血性神經元損傷、氣道上皮細胞炎癥、結腸炎等引起慢性炎癥的動物模型組中，黃芩苷可抑制TLR2／4 及NF-κB 信號通路的活化進而達到抗炎作用［8，24-25］。而慢性炎癥反應是導致腹膜纖維化重要原因之一［26］。

本實驗結果表明，使用黃芩苷治療后，TRAF6、NF-κB的陽性表達明顯低于模型組。此外，α-SMA 作為腹膜間皮細胞轉化為肌成纖維細胞的特異性標志物，在正常腹膜中，間皮細胞不表達α-SMA。當發生病理變化后，可見腹膜間皮細胞及肌成纖維細胞表達α-SMA，本實驗中對照組可見少許α-SMA 陽性表達，模型組中可見大量α-SMA 陽性表達在肌成纖維細胞及新生血管中，而黃芩苷治療組中陽性表達明顯減少。表明黃芩苷可抑制TRAF6 表達，調控NFκB 通路，使腹膜慢性炎癥減輕，從而減緩腹膜纖維化達到改善腹膜結構及功能的作用。