7組同名異型中成藥微生物限度檢查方法

滕 鈺，薛詠蘭，黃 婕，羅 曼，王 俊，徐 洪

（貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004）

貴州省是全國四大中藥產區之一，醫藥產業也是其特色優勢項目［1］，故保證微生物限度檢查方法的完整性與可靠性，是保障當地藥品安全的重要組成部分。同名異型中成藥是指名稱相同、劑型不同的中成藥［2］，貴州省食品藥品檢驗所近年來相關研究涉及到7 組該類型，有的是同一藥企產品，有的為不同藥企生產。包擴獨家品種民族藥、醫院制劑，劑型涉及到丸劑、膠囊、片劑、顆粒劑、洗劑、搽劑。現就上述藥品微生物限度檢查方法適用性研究過程及結果進行分析。

1 材料

1.1 樣品 7 組樣品共涉及8 家生產企業，具體如下。

第1組：日舒安濕巾（批號 5076001、5076002、5076003）、日舒安洗液（批號 4066049、4066080、4066110），貴州漢方藥業有限公司。

第2組：婦科再造膠囊（批號1512003、2026008、2026012），貴州漢方藥業有限公司；婦科再造丸（批號11717053、11717054、11717062），貴州德昌祥藥業有限公司。

第3組：六味地黃膠囊（批號20170102、20170103、20170104），貴州圣濟堂制藥有限公司；六味地黃丸（批號DCXA0401、DCXA0421、DCXA0532），貴州德昌祥藥業有限公司。

第4組：糖寧通絡膠囊（批號20170601、20170901、20171001）、糖寧通絡片（批號 20160401、20161201、20170901），貴州百靈企業集團制藥股份有限公司。

第5組：復方天麻顆粒（批號20170914、20170406、20170710），貴州科輝制藥有限責任公司；復方天麻片（批號20161003、20170301、20170702），貴州百靈企業集團制藥股份有限公司。

第6組：枇杷止咳顆粒（批號180313、180314、180315）、枇杷止咳膠囊（批號180402、180403、180404），貴州神奇藥業有限公司。

第7組：護肝寧片（批號 20180104、20180201、20180203），貴州信邦制藥股份有限公司；護肝寧膠囊（批號20160385、20180386、20160387），貴州益佰制藥股份有限公司。

其中，第1、2 組為獨家品種，第4 組為醫院制劑。

1.2 菌種 黑曲霉［CMCC（F）98003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、生孢梭菌［CMCC（B）64941］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 試劑與培養基 吐溫-80（成都金山化學試劑，批號20170606）。梭菌增菌培養基（批號17070161）、哥倫比亞瓊脂培養基（批號1707171）、胰酪大豆胨液體培養基TSB（批號18030965）、胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA（批號18042762）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號17061281）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基基礎（批號1512232）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基SDA（批號18010864）、沙氏葡萄糖液體培養基SDB（批號18073161）、腸道增菌培養基（批號1609072）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號1610083）、麥康凱液體培養基（批號1703139）、麥康凱瓊脂培養基（批號1604055）、木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂（批號17050483），均購于北京陸橋技術股份有限公司；RV 沙門菌增菌液體培養基（批號3303081），購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 儀器 生物安全柜（美國NuAire 實驗設備公司，型號NU-425-400E）；低溫恒溫培養箱（型號KB240）、電熱恒溫培養箱（型號BF240）（德國賓德公司）；立式自動壓力蒸汽滅菌器 ［致微（廈門）儀器有限公司，型號GR85DA］；電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司，型號ME2002）。

2 方法與結果

2.1 供試液制備 按2015 年版《中國藥典》四部通則1105［3］要求進行制備。其中，日舒安洗液、咳速停糖漿取樣量為10 mL，日舒安濕巾取樣量為100 cm2，其余品種取樣量為10 g，分別加TSB 至100 mL，制成1∶10 供試液，再據品種實際情況選擇合適稀釋倍數進行預試驗。

2.2 菌液制備 按2015 年版 《中國藥典》四部通則1105、1106［3］要求進行制備。

2.3 回收比值計算 計數方法適用性試驗中，回收比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）／菌液對照組菌落數［3］，添加中和劑組的中和劑回收比值=（中和劑對照組菌落數-供試品對照組菌落數）／菌液對照組菌落數［4］。2015 年版《中國藥典》［3］規定，回收比值應在0.5～2 之間，本實驗將其下限提升至0.7 左右，以保證該方法在之后日常檢驗中重復性更佳。

2.4 計數方法適用性試驗

2.4.1 分組 試驗組，按要求在供試液加入“2.2”項下菌液，使每1 mL 供試液中的加菌量不大于100 cfu，混勻；供試品對照組，取供試液，以TSB 代替菌液，其他同試驗組；菌液對照組，取TSB 替代供試液，其他同試驗組；中和劑對照組，取含1%吐溫-80 的TSB 代替供試液，其他同試驗組。以上4 組均取1 mL 混合液，置于90 mm 培養皿中，需氧菌總數計數對應組加入20 mL TSA 培養基，霉菌、酵母菌計數對應組加入20 mL SDA 培養基，分別放至34、23 ℃培養箱中培養3、5 d，計數記錄。

2.4.2 預試驗 據藥品品種成分［5-24］及企業反饋信息，分別在合適稀釋倍數下選擇各品種對應的敏感菌株進行預試驗，結果見表1。

表1 預試驗回收比值

由表可知，第1 組樣品對枯草芽孢桿菌抑制較強，當稀釋倍數到1∶40 時回收比值能達到要求，但其為陰道給藥，計數限度較低，故考慮添加中和劑以消除供試品抑菌活性，減小稀釋倍數。第2 組樣品中，丸劑對白色念珠菌有抑制作用，對需氧菌、霉菌和酵母計數方法需分別擴大稀釋倍數至1∶40、1∶20。第3 組中丸劑對枯草芽孢桿菌抑菌性很強，1∶10 時回收比值為0，稀釋倍數為1∶100時能消除抑菌性。在稀釋倍數為1∶50 時，第4 組樣品對枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌性消除效果好；在需氧菌、霉菌和酵母計數方法考察中，對白色念珠菌的稀釋倍數分別為1∶100、1∶80 時可很好地消除抑菌性。第7組中片劑和膠囊的稀釋倍數分別為1∶100、1∶200 時，能較好消除對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑制作用。

然后，采用含1%吐溫-80 的TSB 作為稀釋液，對第1組樣品進行預試驗，結果見表2，可知吐溫-80 可有效消除該品種對3 株菌的抑菌作用，而且對試驗菌的生長無明顯影響。再通過預試驗回收比值結果確定供試液稀釋倍數，見表3。

表2 日舒安洗液、日舒安濕巾添加中和劑預試驗回收比值

表3 計數方法稀釋倍數

2.4.3 正式試驗 根據表3 中的稀釋倍數，進行各品種3個批次計數方法的適用性試驗，結果見表4。由表可知，除六味地黃膠囊的金黃葡萄球菌回收比值稍低外，其余品種均基本在0.7 以上，表明該計數方法能較好地保證其重復性，方法可行。另外，結合表3～4 可知，第1、4～6 組內樣品計數方法一致，而第2～3、7 組內樣品計數方法不同。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

2.5.1 檢查項目與方法 按照2015 年版《中國藥典》四部通則1106、1107 規定［3］，以給藥途徑和是否含藥材原粉為指標確定了控制菌檢查項目：陰道給藥制劑需控制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和生孢梭菌，固體口服制劑均需控制大腸埃希菌，含藥材原粉的還需控制沙門氏菌和耐膽鹽革蘭陰性菌。根據7 組樣品情況，參照黎春彤［25］、李力等［26］報道的方法，結合藥典規定，在規定溫度和最短時間下培養，以期檢出所加試驗菌相應的反應特征［3］。

表4 各品種計數方法適用性試驗結果

2.5.2 結果分析 當培養基體積如表5 所示時，能檢出相應陽性對照菌，表明該方法可行。其中，第1 組樣品需培養基稀釋法才能去除抑菌作用；第2 組樣品需采用培養基稀釋法才能檢出沙門氏菌和耐膽鹽革蘭陰性菌陽性對照菌；第3 組膠囊劑對大腸埃希菌和沙門氏菌的抑制作用較丸劑弱，但其耐膽鹽革蘭陰性菌需采用比同組丸劑更大的培養基稀釋倍數才能消除對陽性對照菌的抑制；第7 組樣品采用培養基稀釋法檢查沙門氏菌；其余組別樣品控制菌用常規方法即可檢出。

3 討論

方法適用性試驗的本質是建立對樣品影響更小、操作得率更高的方法［27］，但其本身工作量大，而且存在不同實驗室方法欠佳、重復勞動過多的問題［28］，去除藥品抑菌性是其中的重點和難點［29］。因此，本實驗在研究前對樣品組分抑菌性進行分析以確定預試驗菌株，再根據藥典對不同給藥途徑的限度規定，確定最終的計數方法；對控制菌檢查法，主要結合給藥途徑、是否含藥材原粉2 個方面來開展研究，能有效提高方法適用性試驗的效率。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗結果

由于中藥材品種繁多、臨床要求不同、藥材所含成分之間相互作用關系復雜等原因，需將藥材制成各種不同劑型以滿足用藥需要［30］。本實驗中7 組同名異型中成藥原藥材、功能主治一致，但由于劑型不同，其生產工藝與輔料會有所差異，最終導致抑菌活性的區別。劉康連等［31］曾對同一企業生產的5 組含藥材原粉的同名異型中藥制劑進行微生物限度檢查方法適用性研究，發現均存在方法差異；本實驗發現，含藥材原粉的不同劑型中成藥微生物限度檢查方法均不一致，尤其在計數方法上的差別較明顯，這與前期報道結果一致；對于不含藥材原粉的不同劑型中成藥，雖然某些試驗菌回收比值存在差異，但即使不屬于同一企業生產，也可以做到方法統一。