樟芝三萜酸機(jī)械化學(xué)提取工藝的優(yōu)化

何榮軍，許 鵬，董 要，張 岳，蘇為科?

（1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014）

樟芝Antrodia cinnamomea又名樟菇、血靈芝、靈芝之王等［1］，是20 世紀(jì)90 年代在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)的藥用多孔菌，寄生于臺(tái)灣特有的保育類樹(shù)種——牛樟樹(shù)Cinnamomum kanehirai上［2］，具有抗癌、保肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。目前，從樟芝中分離得到的化學(xué)成分已超過(guò)200 種，包括烷醛、芳香烴、羧酸、脂肪酸酯、腺苷、精油、多糖、三萜等，其中三萜類主要活性物質(zhì)［3］，但其傳統(tǒng)提取方法得率低下，提取時(shí)間長(zhǎng)，并使用大量有機(jī)溶劑，從而污染環(huán)境。

響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，劉軍海［4］用該方法優(yōu)化了白術(shù)多糖提取工藝。1919 年，德國(guó)研究人員Ostwald 初次提出了由機(jī)械力誘發(fā)化學(xué)反應(yīng)的概念，近幾年來(lái)機(jī)械化學(xué)越來(lái)越多地被應(yīng)用到植物有效成分提取中［5-8］。為了提高樟芝三帖酸提取效率，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化該成分機(jī)械化學(xué)提取工藝，以期為其開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥 紅樟芝，培養(yǎng)時(shí)間7 個(gè)月，由浙江利民藥業(yè)有限公司提供，粗粉（過(guò)40 目篩）備用。熊果酸對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。氯仿、冰醋酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、濃硫酸、濃鹽酸、高氯酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 PM 200 行星式球磨儀，配置50 mL 不銹鋼球磨罐、10 mm 不銹鋼球磨珠（德國(guó)Retsch 公司）；Agilent 1200 series 高效液相色譜儀，配置Inertsi ODS-3 反相柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）、DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。

2 方法

2.1 三萜酸含有量測(cè)定 以熊果酸為對(duì)照品，香草醛-冰乙酸法測(cè)定含有量。精密稱取熊果酸對(duì)照品2.0 mg，乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得0.2 mg／mL 相應(yīng)溶液，精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL 試管中，不足1 mL 的乙醇補(bǔ)至1 mL，于100 ℃水浴上蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，振搖使其充分溶解混勻，然后加入1.0 mL 高氯酸溶液，振搖混勻，于70 ℃水浴顯色反應(yīng)15 min，冰水浴冷卻5 min，流動(dòng)自來(lái)水調(diào)節(jié)至室溫。各試管加入5 mL 冰乙酸稀釋，振蕩搖勻，15 min 后進(jìn)在545 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸［9］，得方程為Y=0.125A-0.010（R2=0.998 0）。

2.2 藥材提取 稱取藥材粗粉5.0 g 于球磨罐中，加入固相試劑（NaHCO3或Na2CO3），混勻，加入占球磨罐體積1／3 的球磨珠，于球磨機(jī)中球磨，然后粉末轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入水?dāng)嚢杼崛。? 700 r／min 離心10 min，取上清液，再加4 倍上清液體積的95% 乙醇，4 ℃下靜置過(guò)夜，再次離心，上清液濃縮后調(diào)pH 至2～3，氯仿萃取3 次，合并氯仿層。

2.3 三萜酸得率計(jì)算 提取液用乙醇稀釋到一定濃度后，過(guò)0.45 μm 尼龍膜，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算得率Y，公式為，其中C為三萜酸質(zhì)量濃度，N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，M為樟芝質(zhì)量。

2.4 工藝優(yōu)化 在料液比1∶30，50 ℃下提取30 min 的條件下，考察各機(jī)械球磨參數(shù)的影響。固相堿類型：球磨20 min，轉(zhuǎn)速300 r／min，固相堿用量占原料質(zhì)量的10%，考察硅膠、Na2CO3、NaHCO3對(duì)三萜酸得率的影響。轉(zhuǎn)速：NaHCO3用量占原料質(zhì)量的10%，球磨20 min，考察200、250、300、350、400、450、500 r／min 對(duì)三萜酸得率的影響。球磨時(shí)間：NaHCO3用量占原料質(zhì)量的10%，轉(zhuǎn)速300 r／min，考察球磨5、10、15、20、25、30 min 對(duì)三萜酸得率的影響。固相堿用量：球磨20 min，轉(zhuǎn)速300 r／min，考察0、5%、10%、15%、20% 固相堿對(duì)三萜酸得率的影響。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇球磨轉(zhuǎn)速（A）、球磨時(shí)間（B）、助磨劑（固相堿）用量（C）作為影響因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平

2.5 三萜酸熱回流提取及其分離純化 稱取藥材粉末5.0 g，按料液比1︰20 加入78%乙醇，90 ℃下加熱攪拌，回流提取81 min，提取物4 700 r／min 離心10 min，抽濾，重復(fù)3 次，合并濾液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。濃縮后，依次用氯仿、飽和NaHCO3溶液萃取得三萜酸［10］。

2.6 三萜酸的聲輔助提取及其分離純化 稱取藥材粉末5.0 g，加入100 mL 90% 乙醇，超聲提取2 次。每次40 min，超聲功率400 W，提取物4 700 r／min 離心10 min，抽濾，重復(fù)3 次，合并濾液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。濃縮后，依次用氯仿、飽和NaHCO3溶液萃取得三萜酸［11］。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 固相堿類型 樟芝三萜在25 位碳上大多鏈接羧基基團(tuán)，顯酸性，在高能機(jī)械力作用下可能與固相堿反應(yīng)生成水溶性物質(zhì)，由于NaOH 堿性太強(qiáng)，會(huì)破壞三萜結(jié)構(gòu)，故選擇Na2CO3、NaHCO3，同時(shí)與硅膠進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，與NaHCO3球磨時(shí)三萜酸得率明顯高于與Na2CO3球磨時(shí)，其可能原因是Na2CO3堿性比較強(qiáng)，在機(jī)械化學(xué)反應(yīng)中可使三萜結(jié)構(gòu)破損；NaHCO3堿性相對(duì)較弱，對(duì)保持其結(jié)構(gòu)的完整性更加有利，故選擇NaHCO3作為固相堿。

圖1 固相堿類型對(duì)三萜酸得率的影響

3.1.2 助磨劑用量 圖2 顯示，當(dāng)NaHCO3用量由0 增加到10%時(shí)，三萜酸得率明顯升高，而繼續(xù)增加時(shí)其得率先降低后升高，并且趨勢(shì)較平緩，故選擇10% 作為助磨劑用量。

圖2 助磨劑用量對(duì)三萜酸得率的影響

3.1.3 球磨時(shí)間 圖3 顯示，三萜酸得率隨著球磨時(shí)間延長(zhǎng)呈先增后減的趨勢(shì)，在20 min 時(shí)最大，這可能是由于球磨時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成罐體溫度升高，從而化合物結(jié)構(gòu)被破壞，故選擇20 min 作為球磨時(shí)間。

圖3 球磨時(shí)間對(duì)三萜酸得率的影響

3.1.4 球磨轉(zhuǎn)速 圖4 顯示，三萜酸得率隨著轉(zhuǎn)速增加呈先增后減的趨勢(shì)，在300 r／min 時(shí)最大，這可能是因?yàn)殡S著球磨轉(zhuǎn)數(shù)增大，供能增加，有利于細(xì)胞壁破碎釋放有效成分，粉末粒度減小，得率提高；但轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度增大，產(chǎn)生過(guò)多能量，致使體系溫度升高，破壞有效成分，得率反而降低，故選擇300 r／min 作為球磨轉(zhuǎn)速。

3.2 Box-Behnken 響應(yīng)面分析 結(jié)果見(jiàn)表2。然后，以三萜酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y），進(jìn)行17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5 個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析，通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行擬合，得回歸方程為Y=0.381 79+6.489 17 ×10-3A+0.039 264B+0.088 830C-1.039 33×10-5A2-8.598 40×10-4B2-3.364 00×10-3C2。

圖4 球磨轉(zhuǎn)速對(duì)三萜酸得率的影響

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析見(jiàn)表3。由表可知，模型F值高度顯著（11.66），擬合度較好；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明方程不失擬，能充分反映實(shí)際情況。綜合分析，各因素對(duì)三萜酸得率的影響程度依次為球磨轉(zhuǎn)速＞球磨時(shí)間＞助磨劑用量。

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5。在此基礎(chǔ)上結(jié)合回歸方程可知，最優(yōu)提取工藝為球磨轉(zhuǎn)速312.30 r／min，球磨時(shí)間22.83 min，助磨劑用量13.20%。考慮到實(shí)際操作情況，將其修正為球磨轉(zhuǎn)速312 r／min，球磨時(shí)間23 min，球磨劑用量13.20%，三萜酸得率為0.239%。

圖5 各因素響應(yīng)面圖

為了驗(yàn)證回歸模型的可靠性，按照優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，三萜酸得率為0.238%，與預(yù)測(cè)值（0.239%）相當(dāng)，表明工藝穩(wěn)定可行。

3.3 提取方法比較 表4 顯示，機(jī)械化學(xué)提取時(shí)三萜酸得率明顯高于乙醇回流提取和超聲提取，而且時(shí)間更短，溫度更低，表明其提取效果更優(yōu)。

表4 3 種提取方法比較

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面法，得到樟芝三萜酸最優(yōu)機(jī)械化學(xué)提取工藝為球磨轉(zhuǎn)速312 r／min，球磨時(shí)間23 min，固相堿（NaHCO3）用量13.20%，以水為提取溶劑，按1∶30 料液比在50 ℃下機(jī)械攪拌提取30 min，抽濾得提取液，加入4 倍量95% 乙醇，靜置沉淀24 h 后，4 700 r／min離心10 min，上清液調(diào)pH 至2～3，氯仿萃取，即得，三萜酸得率為0.238%。與乙醇熱回流提取法、超聲輔助提取法比較，機(jī)械球磨提取不僅可提高三萜酸得率，還可縮減時(shí)間，提高效率，同時(shí)提取溶劑用水代替了乙醇，減少了有機(jī)試劑用量，更加綠色環(huán)保，從而使樟芝更好地發(fā)揮抗癌、保肝、抗炎等藥理作用。