仙茅鹽炙工藝的優(yōu)化

呂彤彤 ，鞠成國，2?，劉博男，賈天柱，2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600）

仙茅為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖［1］，始載于 《雷公炮炙論》，其性辛、溫，味苦，有毒，歸肝、腎經(jīng)［2］，具有補腎助陽、益精血、強筋骨、行血消腫的功效。現(xiàn)代植物化學研究表明，仙茅成分比較復雜，主要包括酚及酚苷類、木脂素類、皂苷元及皂苷類、黃酮類、桉烷類、脂肪族類、生物堿類、甜味蛋白、多糖類、揮發(fā)油等［3-6］；現(xiàn)代藥理研究顯示，仙茅主要具有抗氧化、抗骨質疏松、增強免疫、補腎壯陽、抗炎、抗憂郁、抗老年癡呆等作用［7-12］，臨床上多用于治療骨質疏松癥、乳腺增生、絕經(jīng)后關節(jié)炎、更年期綜合征及陽痿、再生障礙性貧血、原發(fā)性高血壓等疾病；中醫(yī)臨床上常用其炮制品以增強補益作用，但2015 年版《中國藥典》還未收載酒仙茅、鹽仙茅等炮制品。

基于“入鹽走腎臟”傳統(tǒng)炮制理論，仙茅經(jīng)鹽炙后可引藥下行入腎，明顯增強其補肝腎強筋骨的作用。另外，酚苷類是仙茅補肝腎、強筋骨的物質基礎，其中仙茅苷為苯甲酸酯酚苷類，是其補肝腎的有效成分之一，更是藥典規(guī)定的指標性成分；苔黑酚葡萄糖苷為苔黑酚類酚苷，是仙茅強筋骨的有效成分之一，含有量最高［13-15］。目前對鹽炙仙茅的研究較少，本實驗擬結合UPLC 法，以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量為評價指標，采用正交試驗對鹽炙工藝進行優(yōu)化，以期為該藥材規(guī)范化、標準化、工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Waters H-Class UPLC 超高效液相色譜儀（包括四元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、蒸發(fā)光散射檢測器、Empower2 數(shù)據(jù)處理工作站，美國Waters 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA1004B 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DFT-100 型高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試藥 仙茅購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定室翟延君教授鑒定為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖。仙茅苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號MUST-15062710，含有量99.17%）；苔黑酚葡萄糖苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批 號MUST-14041601，含 有 量98.81%）。食 鹽（江蘇金橋鹽化集團古淮制鹽有限公司，GB5461）；甲醇、磷酸、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 鹽炙品制備 取適量凈仙茅段20 g 置適宜容器內(nèi)，加入鹽水（取0.4 g 鹽，以不同鹽水比例拌勻）悶潤，待鹽水被吸盡后置炒制容器內(nèi)，不同溫度下不斷翻炒一段時間，取出，放涼，打粉，即得［16］。

2.2 仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量測定

2.2.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～4 min，3%A；4～5 min，5% A；5～5.5 min，7% A；5.5～6 min，10% A；6～8 min，11% A；8～8.5 min，12% A；8.5～9.5 min，13%A；9.5～10 min，13%A；10～13 min，15% A；13～15 min，15% A）；檢測波長220 nm；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。理論板數(shù)按仙茅苷計算應不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取仙茅苷對照品4.11 mg、苔黑酚葡萄糖苷對照品2.21 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，稀釋得到0.102 75、0.110 5 mg／mL 對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 稱取不同條件下鹽炙品粉末（過3 號篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流2 h，取出，放冷，稱定質量，甲醇補足減失質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，移至10 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 單因素試驗

2.3.1 鹽水比例 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶4、1∶5、1∶7、1：10、1∶15、1∶20）至密閉容器內(nèi)，悶潤3 h 后，于140～150 ℃下炒制5 min 后出鍋，放涼，備用，結果見表1。由表可知，不同鹽水比例下酚苷含有量有所差異，表明鹽水比例是影響仙茅酚苷含有量變化的主要因素；鹽水比例1∶7、1∶10、1∶15 時雖然含有量差異不足10%，在誤差允許范圍內(nèi)，但在實際操作過程中1∶7 和1∶10 存在鹽水與飲片無法完全拌勻的情況，所以結合實際，選擇1∶15 進行正交試驗。

2.3.2 炒制溫度 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)悶潤3 h，分別在120～130、130～140、140～150、150～160、160～170、170～180 ℃下炒制5 min 后取出，晾涼，備用，結果見表2，采用120～130 ℃進行正交試驗。

2.3.3 炒制時間 取飲片5 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)悶潤3 h，在140～150 ℃下分別炒制3、4、5、6、7 min 后取出，放涼，備用，結果見表3，可知炒制時間為5 min 時，綜合評分最高，故選擇其進行正交試驗。

表2 炒制溫度考察結果Tab.2 Results of frying temperature investigation

表3 炒制時間考察結果Tab.3 Results of frying time investigation

2.3.4 悶潤時間 取飲片6 份，每份20 g，加入鹽水（每100 kg 藥材用食鹽2 kg，比例1∶7）至密閉容器內(nèi)分別悶潤1、2、3、4、6、8 h，在140～150 ℃下分別炒制5 min 后取出，放涼，備用，結果見表4，可知悶潤時間超過2 h 后酚苷含有量變化不大，表明悶潤時間不是其主要因素。

表4 悶潤時間考察結果Tab.4 Results of dull time investigation

2.4 正交試驗 由上述單因素考察可以看出，影響鹽炙仙茅酚苷成分的主要因素有鹽水比例、炒制溫度、炒制時間。以仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量為評價指標，按L9（34）正交試驗表進行優(yōu)化。因素水平見表5，結果見表6，方差分析見表7。

表5 因素水平Tab.5 Factors and levels

表6 試驗設計與結果Tab.6 Design and results of tests

表7 方差分析Tab.7 Analysis of variance

結果表明，鹽水比例（A）和炒制時間（C）是影響仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷含有量的主要因素，各因素影響程度依次為炒制時間（C）＞鹽水比例（A）＞炒制溫度（B）。綜合分析，確定最佳工藝為A2B1C2，即每100 kg 仙茅飲片用2 kg 食鹽（食鹽∶水=1∶15），悶潤2 h，在110～120 ℃下炒制5 min。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別取仙茅苷對照品0.010 3、0.030 8、0.051 4、0.102 8、0.154 1、0.205 5 μg，苔黑酚葡萄糖苷對照品0.022 5、0.045 0、0.067 5、0.090 0、0.112 5、0.135 0 μg，在“2.2.1”項條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，得仙茅苷回歸方程為Y=2×106X-4 094.7（r=0.999 3），在0.010 3～0.205 5 μg 范圍內(nèi)線性關系良好；苔黑酚葡萄糖苷回歸方程為Y=4×106X+4 556.5（r=0.999 4），在0.022 5～0.135 0 μg 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 精密稱取鹽炙品1 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進樣測定6 次，每次1 μL，測得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面積RSD 分別為1.21% 和0.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 吸取同一份供試品溶液，在“2.2.1”項條件下于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定，每次1 μL，得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.76%和0.43%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批鹽炙品粉末6 份，每份1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下各吸取1 μL 進樣測定，測得仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量RSD 分別為1.6% 和0.97%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱定仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷含有量已知的鹽炙品粉末6 份，每份0.1 g，分別加入2 種對照品粉末0.15 mg 和0.59 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進樣測定，結果見表8。

表8 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.8 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.6 驗證試驗 取3 批生品（每批100 g），按優(yōu)化工藝制備3 份樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進樣測定，結果見表9，可知仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷平均含有量分別為0.10%和0.490 2%，綜合評分99.2，表明工藝穩(wěn)定可靠，合理可行。

表9 驗證試驗結果（n=3）Tab.9 Results of verification tests（n=3）

3 討論

為了更準確地檢出酚苷類成分，色譜柱考察了ACQUITY UHPLC BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）和Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相考察了甲醇或乙腈與0.1%磷酸或甲酸的不同比例，檢測波長考察了220、280 nm，最終確定為“2.2.1”項下條件。

酚苷類是仙茅補肝腎、強筋骨的物質基礎［17］，故選用其中含有量較高的苔黑酚葡萄糖苷和藥典指標成分仙茅苷作為評價指標，并進行加權求和（權重比例設為1∶1），優(yōu)化仙茅鹽炙工藝，具有一定的科學性與合理性。仙茅苷和苔黑酚葡萄糖苷作為仙茅酚苷類主要成分，含有量測定方法有薄層層析-紫外分光光度法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等，本實驗采用UPLC 法［18］，與HPLC法相比操作簡便，結果準確，重復性好。