吳茱萸不同入藥形式的成分差異

李 斐，董嘉皓，魏飛亭，喬日發，陳海芳，楊武亮，楊 明，袁金斌

（江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004）

中藥的入藥形式多種多樣，有的以粉末直接入藥，如散劑、丸劑；有的以提取物的形式入藥［1-3］。入藥形式不同，所含化學成分會有差異，藥物功效也存在區別，不同入藥形式對中藥藥效或毒性的影響可通過化學成分含有量的變化來分析。

吳茱萸為吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia ru-taecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實，性熱，味辛、苦；有小毒［4］。臨床上，吳茱萸的入藥形式主要有2 種，為粉末入藥，如戊己丸；為水煎劑，如復方吳茱萸湯、左金方。中醫的遣方用藥有其科學內涵，揭示吳茱萸在不同方藥中的用藥特點，弄清楚不同入藥形式中化學組分含有量的差異是其基礎和前提。

吳茱萸主要含生物堿、黃酮、檸檬苦素、酚酸、揮發油等［4-6］，已有的研究主要集中在生物堿和檸檬苦素類［4-5，7-8］，較少涉及黃酮、酚酸類［9-11］。根據文獻［9-11］和前期研究［12-14］，課題組選取了9個代表性化合物作為含有量測定指標，分析吳茱萸不同入藥形式中化學成分的差異。本研究充分優化了UPLC 條件，建立了吳茱萸2 種提取物中多成分含有量的同時測定方法，以期為該藥材用藥特點、藥效物質基礎和質量評價研究提供依據。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；AE240 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；PS-80 A 超聲波清洗機（東莞市潔康超聲波設備有限公司）；L-500 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；116B 型高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

新綠原酸（批號CFN97472）、隱綠原酸（批號CFN99117）對照品購自武漢天然植物生物技術有限公司；綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-200413、110802-200504、0801-9702；蘆丁、金絲桃苷對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為16122011、16 102605；去氫吳茱萸堿（批號P24M7F11741）對照品購自上海源葉生物科技有限公司；吳茱萸新堿（批號15266-38-3）對照品購自上海胤珂生物科技有限公司，以上對照品質量分數≥98%。乙腈和甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純。

藥材均為課題組實地采集，信息見表1，標本保存于江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿對照品適量，置于10 mL 量瓶中，無水甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得單一成分貯備液。分別精密吸取上述9 個貯備液1 mL 加入10 mL 量瓶中，無水甲醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為0.228、0.506、0.198、0.021、0.126、0.252、0.501、0.252、0.511 mg／mL 的對照品溶液。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.1.2 供試品溶液

2.1.2.1 吳茱萸醇提液［12］藥材放入60 ℃烘箱中烘2 h，粉碎，取粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質量，浸泡1 h 后超聲40 min，放冷，再稱定質量，70%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2.2 吳茱萸水煎液 取上述藥材粉末約0.3 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水25 mL，稱定質量，浸泡1 h 后加熱回流40 min，放冷，再稱定質量，雙蒸水補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，4%～5% B；3～9 min，5%～6% B；9～12 min，6%～8%B；12～15 min，8%～20%B；15～20 min，20%～35% B；20～27 min，35%～80% B；27～35 min，80%～100%B；35～40 min，100%B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長326 nm；進樣量1 μL。在該色譜條件下，各目標化合物獲得了較好的分離，見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 依次稀釋上述對照品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，以信噪比（S／N）分別為10 和3 時的質量濃度為定量限和檢測限。結果見表2。

2.3.2 精密度試驗 分別吸取水煎液、醇提液，在“2.2”項條件下進樣測定，測得水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積 RSD 分別為1.2%、0.4%、0.8%、1.8%、0.9%、0.5%，醇提液中分別為0.9%、0.6%、0.7%、0.9%、0.6%、0.7%、0.6%、0.5%、0.8%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關系、檢出限、定量限Tab.2 Linear relationships，detection limits and quantitative limits of various constituents

2.3.3 穩定性試驗 取藥材粉末，按“2.1.2”項下方法制備2 種供試品溶液，室溫下靜置0、2、4、6、12、24 h 后在“2.2”項條件下進樣測定，測得煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積RSD 分別為1.8%、0.5%、2.4%、1.7%、0.9%、0.5%，醇提液中分別為1.7%、1.5%、1.9%、1.4%、1.0%、1.1%、0.8%、1.0%、1.1%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批藥材12 份，按“2.1.2”項下方法制備2 種供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，測得水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿峰面積RSD 分別為2.4%、0.6%、2.2%、1.6%、2.0%、0.4%，醇提液中分別為2.2%、1.7%、2.3%、2.1%、1.3%、1.0%、1.1%、1.6%、1.3%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 稱取含有量已知的藥材12 份，分成2 組，分別精密加入相當于樣品指標成分量100% 的9 種成分對照品貯備液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，計算回收率。結果，水煎液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿平均加樣回收率分別為100.4%、98.8%、100.3%、99.9%、100.6%、99.2%，RSD 分別為1.2%、1.1%、1.4%、0.6%、1.6%、2.0%；醇提液中平均加樣回收率為99.7%、102%、101.2%、99.3%、101.2%、98.4%、98.7%、100.9%、101.1%，RSD 分別為2.9%、2.7%、2.7%、1.4%、2.7%、2.4%、2.0%、2.5%、2.1%。

2.4 不同入藥形式的影響

2.4.1 入藥形式選擇 吳茱萸的傳統用藥方式為水煎液和粉末，前者一直作為中藥的傳統入藥形式，可提取到相對有效的化學成分，有一定的合理性。吳茱萸70%乙醇提取液保留了其絕大多數化學成分，2015 年版《中國藥典》也以其為提取溶劑，故粉末可用70%乙醇提取液代替。

2.4.2 成分組成 課題組挑選了10 批藥材，涵蓋了三大品種、主要產區、不同年份。圖1 表明，醇提物中的成分較多，包括酚酸、黃酮、檸檬苦素、吲哚類生物堿和喹諾酮類生物堿；水煎液中的成分則集中在色譜圖的前半部分，大多為水溶性成分（如酚酸、黃酮、吲哚類生物堿），幾乎不含極性較弱的喹諾酮類生物堿。

2.4.3 含有量測定 由表3 可知，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含有量以樟樹豐溪產最高，去氫吳茱萸堿含有量以貴州凱里產最高，吳茱萸堿、吳茱萸次堿含有量以湖南黔陽產最高，吳茱萸新堿含有量以江西新干產最高。

另外，醇提液（對應于粉末入藥形式）中各化合物含有量都不低，表明70%乙醇對吳茱萸各組分有較高的提取效率；水煎液中含有量顯著低于醇提物中，以吳茱萸新堿為代表的喹諾酮類生物堿均未檢測到。值得注意的是，水煎液中隱綠原酸含有量顯著高于醇提物中（超出平均值1.6 倍），2號色譜峰（綠原酸）前的1 個色譜峰平均峰面積之比（水煎液／醇提液）也是1.6，見圖1。

表3 各成分含有量測定結果（%， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n=3）

3 討論與結論

王智民［5］曾指出生物堿在水煎劑中的轉移率很低，而其水溶性比較大的成分（如去氫吳茱萸堿、黃酮、綠原酸等）則相對較高，這些成分與吳茱萸的藥理活性是否有關還有待深入研究。由于綠原酸不穩定，通過同時測定其3 種同分異構體含有量更能準確可靠地評價酚酸類成分在醇提液和水煎液中的差異，因此本研究系統報道了吳茱萸中綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸含有量的同時測定。為比較吳茱萸2 種入藥形式對其組分的影響，本實驗選取了9 個代表性化合物，可較好地反映其整體變化。

吳茱萸在臨床應用上主要用于鎮痛、止嘔，文獻表明其醇提液的鎮痛效果更好［8，15］，藥效可能與部分生物堿類成分相關；水煎液的止嘔作用更明顯，活性物質大多為水溶性成分［13］。血清藥理學研究發現，除酚酸類及黃酮類外，生物堿類的代謝產物也較多，表明吳茱萸藥理作用可能是多個成分共同作用的結果［16］。由于粉末中成分類型較全，含有量較高，故從藥效（特別是鎮痛作用）方面而言，它可能是一種較好的入藥形式。

歷代本草均記載吳茱萸有小毒，現代研究表明其毒性程度依次為揮發油＞醇提物＞水提物［14，17-19］。吳茱萸的肝毒性可能與極性較弱的生物堿，尤其是喹諾酮類生物堿有關［14，19］，而它在水煎液中的轉移率極低，因此從用藥的安全性來說，水煎劑是一種比較合適的用藥形式。

中醫的遣方用藥有其科學內涵，綜合考慮了藥物功效、毒性、安全，反映了對藥物活性組分的取舍。于吳茱萸而言，有時候主要利用其鎮痛功效，有時候側重其止嘔效果，有時候需長期用藥而必須考慮其安全性，這時候用藥形式也應加以考慮，如鎮痛施丸劑（粉末），止嘔用湯劑（水煎）。