基于網(wǎng)絡藥理學探討菊葉香藜精油藥理活性及作用機制

付蘇宏，張勇群，郝豆豆，張鵬飛，施 靜

（西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院 分子醫(yī)學實驗室，四川 成都 610000）

菊葉香藜Dysphania schraderiana屬藜科刺藜屬植物，廣泛生長于我國高海拔地區(qū)，如西藏、青海、內蒙古等省份［1］。作為傳統(tǒng)蒙藥，菊葉香藜全草入藥，用于治療頭痛、感冒、金傷、麻疹不透、皮膚瘙癢［2］，富含精油而帶有強烈的刺鼻性氣味。大量研究表明，精油對人體有著重要的調節(jié)作用，因此，菊葉香藜精油也具有潛在的生物活性功能，近年來陸續(xù)報道了其生物活性研究。雷鳴等［3］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油可濃度依賴地抑制昆蟲玉米象的活力；石夢菲等［1］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油可抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長；劉志龍等［4］發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油具有防治植物螨蟲的功效。此外，課題組前期利用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）對菊葉香藜精油的化學成分進行了鑒定，總共鑒定出52 種化合物，主要為脂肪族類化合物（54.23%）和萜類化合物及其含氧衍生物（31.94%）［1］。有研究表明，α-杜松醇表現(xiàn)出強烈的抗螨蟲活性［5］；紫蘇醇可以通過作用于自由基治療腦瘤［6］；β-欖香烯可通過誘導凋亡抑制多種腫瘤細胞的增殖［7］。然而，菊葉香藜精油中的化學成分眾多且復雜，并呈“多成分、多靶點”相互協(xié)同作用，因此綜合分析菊葉香藜精油的藥理功能和作用機制顯得更為重要。

隨著生物技術的不斷進步，各類“組學”技術相繼出現(xiàn)，海量數(shù)據(jù)的產生和計算方法的飛速發(fā)展標志著人類已經(jīng)進入一個全新的生物信息時代［8］。基于此，英國藥理學家Hopkins 于2007 年率先提出網(wǎng)絡藥理學的概念，通過各類組學技術、網(wǎng)絡分析與可視化技術來揭示藥物、靶點、疾病之間錯綜復雜的關系，多層面地分析疾病的分子基礎、預測藥物的藥理學作用機制，彌補傳統(tǒng)藥理試驗研究盲目、耗時長、費用高、不系統(tǒng)等弊端［9］。目前網(wǎng)絡藥理學已被廣泛用于構建“藥物分子-靶標-功能”網(wǎng)絡，高耀等［10］應用網(wǎng)絡藥理學的方法揭示了逍遙散與開心散“同病異治”抑郁癥的作用機制；任瑩璐等［11］采用網(wǎng)絡藥理學的方法構建了芪參顆粒治療心血管疾病的“成分-靶點調控網(wǎng)絡”，這些研究充分證明對于化學成分組成復雜多樣的傳統(tǒng)方劑來說，網(wǎng)絡藥理學是揭示其藥理作用機制的有效方法。因此，本研究將基于網(wǎng)絡藥理學的研究思路與方法，構建菊葉香藜精油“化學成分-靶標-功能”網(wǎng)絡，預測其作用機制，為今后相關藥理功效研究與應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菊葉香藜精油化學組成鑒定 菊葉香藜精油化學成分通過GC-MS 測定，共鑒定得到52 個化合物［1］。表1 列舉了精油化學成分的中文名，以及在PubChem 數(shù)據(jù)中的編號。

表1 菊葉香藜精油化學組成Tab.1 Chemical compositions of essential oil in Dysphania schraderiana

1.2 菊葉香藜精油化學成分靶點預測 BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫可對化合物與靶點蛋白的相關性進行評分，利用在線數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）對菊葉香藜精油中的化學成分的作用靶點蛋白進行預測［12］，通過參數(shù)設置可篩選得到可信度較高的蛋白靶點。分別輸入51 個化合物的PubChem 編號進行檢索（其中1 個未查詢到相應的PubChem 編號），設置靶點的打分閾值為55，AdjustedP值為0.05，獲取每一個化合物所對應的作用靶點。

1.3 靶點蛋白的生物功能分析 生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov／）提供一套綜合的功能注釋工具，可幫助研究者理解基因或蛋白背后的生物學意義［13］。將上述篩選得到的靶點蛋白導入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，篩選P＜0.05 的GO 條目和KEGG 通路。

1.4 “化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建 利用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行TTD（Therapeutic Target Database，TTD）疾病分類，獲取疾病富集信息。篩選顯著性前20 的TTD 疾病分類，整理其對應的靶點蛋白信息以及靶點蛋白對應化學成分信息，利用Cytoscape 3.6.1 本地軟件［14］構建“化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，并對網(wǎng)絡圖的節(jié)點大小、形狀以及顏色進行設置，獲取最終美化的PPI 網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 菊葉香藜精油作用靶點 運用在線數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM 對菊葉香藜精油的化學成分逐一進行檢索，篩選出分值＞55 的靶點蛋白。52 個化合物中有1 個未檢索到相應的PubChem 編號（1-羰基-2-異丙基-5-甲基-3-環(huán)己烯，相對含有量1.946%），未在BATMAN-TCM 平臺上進行檢索；有3 個化合物在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中未檢索到相應的靶點蛋白［t-杜松醇、α-蓽澄茄油烯和4（14），5-依蘭油烯，相對含有量分別為6.779%、0.561%、0.115%］；有9 個化合物沒有相應的分值＞55 的靶點蛋白［蘭桉醇、喇叭茶醇、δ-綠花白千層醇、石竹素、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、α，α，γ-三甲基-苯丙醇、（Z）-3，7-二甲基-2，6-亞辛基-1-醇丙酸酯、3-甲基-2-丁烯酸乙酯、反式辣薄荷醇相對含有量分別為2.587%、1.582%、1.139%、0.484%、0.216%、0.186%、0.121%、0.074%、0.116%］。去除所有不符合條件的化學成分后，總共有39 種成分及其靶點蛋白展示于圖1 中，其中1，1，3-三甲基茚具有最多的潛在作用靶點（57 個），此外共有17 個化合物的潛在作用靶點為31 個，包括δ-杜松萜烯、長葉烯、（-）-γ-杜松萜烯、β-欖香烯、γ-欖香烯、反式石竹烯、甘香烯、α-律草烯、α-杜松萜烯、大牛兒烯D、4-蒈烯、β-廣藿香烯、α-蒎烯、β-順式-金合歡烯、檸檬烯、α-水芹烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯。

圖1 菊葉香藜精油化學組成與潛在作用靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 Network of chemical compositions and potential targets of essential oil in Dysphania schraderiana

2.2 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 6.8 對上述得到的126 個靶點蛋白進行GO功能與KEGG 通路富集分析。GO 功能分析方面，分子功能分類中較顯著的主要是延遲整流鉀通道活性、腎上腺素結合、去甲腎上腺素結合；細胞組分分類中較顯著的主要是電壓門控鉀通道復合體、質膜整體組分、鈉離子通道復合物；生物過程分類中較顯著的主要是腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號通路、蛋白質同源寡聚、細胞-細胞信號（圖2）；KEGG 通路富集方面，顯著性靠前的通路主要有神經(jīng)活性配體-受體交互作用、視黃醇代謝、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、酪氨酸代謝（圖3）。

2.3 “化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡分析 根據(jù)治療靶點數(shù)據(jù)庫（TTD）對菊葉香藜精油的潛在作用靶點進行數(shù)據(jù)庫疾病分類，顯著性前20 的如表3所示，主要歸屬為心血管系統(tǒng)疾病、疼痛、神經(jīng)精神類疾病。心血管系統(tǒng)疾病主要有高血壓、心律失常、系統(tǒng)性動脈血管舒張、心力衰竭、局部缺血性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化；疼痛疾病主要有疼痛、急性輸尿管的絞痛、偏頭痛；神經(jīng)精神類疾病主要涉及刺激、精神分裂癥、焦慮癥、抑郁癥、可卡因成癮。

圖2 菊葉香藜精油潛在作用靶點GO 功能分析Fig.2 GO functional analysis of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

圖3 菊葉香藜精油潛在作用靶點KEGG 通路富集分析Fig.3 Enriched KEGG pathways of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

表3 菊葉香藜精油潛在作用靶點治療靶點數(shù)據(jù)庫疾病分類Tab.3 Enriched therapeutic target database diseases of potential targets for essential oil in Dysphania schraderiana

分別構建心血管系統(tǒng)疾病、疼痛和神經(jīng)精神類疾病的“化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖（圖4）。如圖4A 所示，1，1，3-三甲基茚通過作用于組胺H1 受體（HRH1）、組胺H2 受體（HRH2）、β3腎上 腺 素 受 體（ADRB3）、β2 腎 上 腺 素 受 體（ADRB2）、α-2B 腎上腺素受體（ADRA2B）與系統(tǒng)性動脈血管舒張、心律失常、高血壓、心力衰竭相關聯(lián)；共18 種精油成分可作用于電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1（KCNQ1）和鳥苷酸環(huán)化酶1β3（GUCY1B3），分別與心律失常和心力衰竭相關聯(lián)，18 種精油成分為γ-欖香烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、大牛兒烯D、檸檬烯、δ-杜松萜烯、β-順式-金合歡烯、α-水芹烯、β-廣藿香烯、α-律草烯、α-蒎烯、（-）-γ-杜松萜烯、長葉烯、α-杜松萜烯、反式石竹烯、甘香烯、β-欖香烯、4-蒈烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯）；P-傘花烴可通過作用于凝固因子Ⅱ（F2）與冠狀動脈粥樣硬化相關聯(lián)，此外，有15 個精油成分可作用于雌激素受體1（ESR1）與冠狀動脈粥樣硬化相關聯(lián)（反式-對-薄荷-2-烯-1-醇、斯巴醇、香榧醇、α-杜松醇、芳樟醇、1-羥基-1，7-二甲基-4-異丙基-2，7-環(huán)癸二烯、α-松油醇、八氫四甲基萘甲醇、三環(huán) ［4.4.0.02，7］癸-8-烯-3-甲醇，α，α，6，8-四甲基-，立體異構體、蓽澄茄油烯醇、α-桉葉油醇、胡蘿卜醇、順式-對-薄荷-2-烯-1-醇、四甲基環(huán)癸二烯甲醇、反式-薄荷醇）。在圖4B 中，1，1，3-三甲基茚可作用于多個蛋白，包括5-羥色胺受體7（HTR7）、5-羥色胺受體2 A（HTR2A）、5-羥色胺受體2C（HTR2C）、煙堿型膽堿能受體α7（CHRNA7）、電 壓 門 控 鈉 離 子 通 道1α 亞 基（SCN1A）、非 電 壓 門 控 鈉 離 子 通 道1α 亞 基（SCNN1A）、腺苷激酶（ADK），與偏頭痛、急性輸尿管的絞痛、疼痛和止痛劑相關聯(lián)；此外，有18 個化合物可作用于電壓門控鉀離子通道亞族D成員3（KCND3）和Discs 大同源物4（DLG4）與疼痛和止痛劑相關聯(lián)［γ-欖香烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、大牛兒烯D、檸檬烯、δ-杜松萜烯、β-順式-金合歡烯、α-水芹烯、β-廣藿香烯、α-律草 烯、α-蒎烯、（-）-γ-杜松萜烯、長葉烯、α-杜松萜烯、反式石竹烯、甘香烯、β-欖香烯、4-蒈烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯］。相較于前2 類疾病，與神經(jīng)精神類疾病相關的化學成分較少，檸檬醛作用于丁酰膽堿酯酶（BCHE）與精神分裂癥相關聯(lián)，桉樹腦作用于瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員8（TRPM8）和瞬時受體電位陽離子通道亞家族A 成員1（TRPA1）與刺激相關聯(lián)，1，1，3-三甲基茚通過作用于多個蛋白與焦慮癥、抑郁癥可卡因成癮、精神分裂癥和刺激相關聯(lián)。

圖4 “化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡Fig.4 Network of“chemical components-targets-diseases”

3 討論

傳統(tǒng)中藥、民族藥是開發(fā)現(xiàn)代新藥的重要資源庫，然而中藥復方具有多成分、多靶點、多層次的特點，作用機制廣泛，不易明確，大大限制了其在臨床上的應用。目前，中藥研究的主要方法是對有效成分進行分離純化，逐一對每個單體進行活性篩選，再作進一步的新藥開發(fā)，這一方法雖然獲得了些許成效，但耗時耗力，花費高，回報小，并且不符合中藥“辨證論治”的理念［11］。隨著“網(wǎng)絡藥理學”概念的提出，將其與中藥研究結合是目前的研究熱點之一［15］，基于多種數(shù)據(jù)平臺充分利用化學成分、疾病靶點已有的研究成果，系統(tǒng)地對中藥組分的作用靶標、協(xié)同作用進行研究，實現(xiàn)中藥新藥的開發(fā)。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法對菊葉香藜精油的潛在作用靶點進行挖掘，并推測其藥理作用機制，預測其可治療的疾病。結果表明，菊葉香藜精油中總共40 種化學成分在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中有其對應的靶點蛋白，總共得到126 個潛在的作用靶點；功能富集分析顯示，總共分類到112 個GO條目，其中較顯著的有電壓門控鉀通道復合體、延遲整流鉀通道活性、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號通路等；總共注釋到25 條KEGG 通路，其中較顯著的有神經(jīng)活性配體-受體交互作用、視黃醇代謝、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、酪氨酸代謝等；富集的TTD 疾病類型共59 類，較顯著的TTD 疾病主要與心血管疾病、疼痛、神經(jīng)精神疾病相關。

在KEGG 通路注釋中，cGMP-PKG 信號通路、醛固酮調節(jié)的鈉重吸收通路、心肌細胞腎上腺素能信號傳導通路、腎素分泌通路、AMPK 信號通路均涉及機體的心血管系統(tǒng)調節(jié)［16-20］，提示這些通路可能是菊葉香藜精油治療心血管疾病的作用機制。此外，菊葉香藜精油的潛在靶點蛋白還富集到神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號途徑、血清素激活的神經(jīng)突觸通路，均與神經(jīng)精神類疾病相關，其中血清素激活系統(tǒng)參與大腦多個區(qū)域的神經(jīng)遞質調節(jié)，血清素失調是目前公認的導致抑郁癥的主要因素［21］；Ca2+在突觸的聯(lián)系調節(jié)中扮演著重要的角色，中樞神經(jīng)的Ca2+失調在多種神經(jīng)精神類疾病如阿爾茨海默癥、雙相感情障礙、精神分裂癥中發(fā)揮著重要的作用［22］，也有研究報道調節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路可改善帕金森癥［23］；炎癥介質調節(jié)的TRP 通道、鈣信號途徑均參與機體疼痛信號的轉導，這可能也是菊葉香藜精油緩解疼痛的主要機制［24-25］。

在“化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡中，有18 種精油成分可作用于電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1（KCNQ1）、鳥苷酸環(huán)化酶 1β3（GUCY1B3）、電壓門控鉀離子通道亞族D 成員3（KCND3）和Discs 大同源物4（DLG4），它們分別與心律失常、心力衰竭、疼痛和止痛劑相關；此外，共有15 種精油成分可作用于雌激素受體1（ESR1），與冠狀動脈粥樣硬化相關聯(lián)。電壓門控鉀離子通道KQT 樣亞家族成員1 與一些心臟功能紊亂有關，包括長QT 綜合征（LQTS）、先天性心房顫動和短QT 綜合征等，是心律失常的重要靶點［26］；鳥苷酸環(huán)化酶1β3 可通過合成信號分子cGMP 來調控對一氧化氮的反應，而一氧化氮是一種很強的舒張血管物質，在心血管功能的調節(jié)中起到重要作用；電壓門控鉀離子通道亞族D 成員3存在于神經(jīng)元中，與神經(jīng)興奮相關［27］，可能與痛覺傳導有關；Discs 大同源物4 是突觸膜關聯(lián)鳥苷酸激酶蛋白家族中的一員，與神經(jīng)突觸下游信號傳導途徑的受體調控、組織和定位密切相關［28］，可能是痛覺傳導過程中重要的一環(huán)；雌激素受體1 可介導雌激素調節(jié)的脂肪細胞分化、脂解作用和抑制脂質合成［29］，而脂質代謝障礙為動脈粥樣硬化的病變基礎。在精油成分中，1，1，3-三甲基茚可與多個靶點相互作用，與心血管疾病、疼痛、神經(jīng)精神疾病均相關，可見該化合物可能具有協(xié)同調節(jié)的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學對菊葉香藜精油進行藥理活性及其作用機制研究，在現(xiàn)有化學成分及其作用靶點研究成果的基礎上進行潛在作用靶點預測，具有較高的準確性。根據(jù)靶點蛋白進行菊葉香藜精油的生物功能分析發(fā)現(xiàn)，多條KEGG通路和疾病富集分析均顯示菊葉香藜精油具有潛在的治療心血管疾病、神經(jīng)精神疾病、疼痛的功效，但還需進一步藥理實驗驗證。本研究揭示了菊葉香藜精油多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，為今后進一步相關藥理活性及其作用機制的考察奠定了基礎。