姜黃素對急性肺損傷小鼠炎癥反應的改善作用

邵 奇，王倩梅，馬善波，張 偉，郭 超?

（1.銅川礦務局中心醫院藥劑科，陜西 銅川 727000；2.空軍軍醫大學西京醫院急診科，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫大學西京醫院藥劑科，陜西 西安 710032）

急性肺損傷是由多種病因引起的，以急性進行性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥等為主要表現的臨床常見急危重癥，病死率可高達30%～40%［1-2］，尋找可靠有效的新型治療靶點仍然是目前亟待解決的關鍵問題之一。近年來眾多學者［3-5］研究發現，從姜黃中提取的多酚類活性成分姜黃素除可用于百草枯中毒、糖尿病、癌癥、帕金森等治療外，還可發揮良好的抗急性肺損傷作用，其作用機制與關鍵分子靶點可能與THF-β1／SMAD、Akt／Erk、MAPK／NF-κB 等多條信號通路相關［6］。本研究通過構建小鼠急性肺損傷動物模型，觀察TLR4／MyD88／NFκB 信號通路在姜黃素改善炎癥反應中的作用。

1 材料

1.1 動物 健康成年SPF 級BALB／c 雄性小鼠50 只，體質量14～26 g，購于空軍軍醫大學西京醫院動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（陜）2014-0013。實驗前，在溫度（22±1）℃、相對濕度45%～75%、光照周期12／12 h 環境中適應性飼養1 周。

1.2 試藥 姜黃素購自四川成都德銳可生物科技有限公司（CAS＃458-37-7，含有量＞99.8%）。LPS購自美國Sigma 公司（L2880）；TLR4 激動劑（牙齦卟啉單胞菌內毒素，LPS-PG）購自上海康朗生物科技有限公司（貨號tlrl-ppglps）；TLR4 抑制劑（瑞沙托維，TAK-242）購自杭州聯科生物技術股份有限公司（貨號2A-13871-5）；TNF-α、IL-1β 和IL-6 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）和核因子-κB（NF-κB）ELISA 試劑盒均購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 包埋機購自上海名元實業有限公司（型號JB-P5）；病理切片機購自上海涵飛醫療器械有限公司（型號RM-2016）；電子顯微鏡購自日本奧林巴斯公司（型號BX50）。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠稱重麻醉后固定于實驗臺，備皮分離氣管和右側頸總動脈，行氣管插管保持呼吸，頸總動脈插管監測血壓，并備用采血通道。急性肺損傷組以5 mg／kg 劑量腹腔注射脂多糖（LPS）建立模型［7］。50 只小鼠隨機分為對照組、急性肺損傷組、姜黃素干預組、TLR4 激動劑組、TLR4 抑制劑組，對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，姜黃素干預組在給予5 mg／kg LPS 前30 min 腹腔注射姜黃素200 mg／kg，TLR4 激動劑組和TLR4抑制劑組分別以3 mg／kg LPS-PG 和TAK-242 在200 mg／kg 姜黃素給予前10 min 腹腔注射［8］。

2.2 肺組織病理形態觀察 快速打開小鼠胸腔，取出肺組織，冰上取左肺，用冰生理鹽水沖洗，取其下方1 ／3 肺組織用于HE 染色及肺組織病理學評分，每組選6 張，每張選4 個視野（×400），計數受損肺泡（肺泡腔RBC 或WBC＞2 個）占肺泡總數的百分比，即肺損傷組織學定量評價指標（IQA）［1，9］，其余肺組織-80 ℃下保存備用。

2.3 ELISA 檢測 腹腔注射LPS 或生理鹽水24 h后，經頸總動脈插管取血，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min 后，吸取上清，依據ELISA 試劑盒說明書，分別測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，以及肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平。

2.4 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料均以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 如表1 所示，與對照組比較，急性肺損傷組小鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預組比較，TLR4 激動劑組小鼠血清三者水平顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組小鼠血清三者水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n=10）Tab.1 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups（±s， n=10）

表1 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n=10）Tab.1 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups（±s， n=10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預組比較，＆＆P＜0.01

3.2 肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平 如表2所示，與對照組比較，急性肺損傷組小鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預組小鼠肺組織三者水平顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預組相比，TLR4 激動劑組小鼠肺組織三者水平顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組小鼠肺組織三者水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平比較（±s， n=10）Tab.2 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB levels in lung tissues among various groups（±s， n=10）

表2 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平比較（±s， n=10）Tab.2 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB levels in lung tissues among various groups（±s， n=10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預組比較，＆＆P＜0.01.

3.3 肺組織病理學變化及評分 光鏡下可見對照組小鼠肺泡結構比較完整，肺泡壁薄，肺泡腔輪廓清晰；急性肺損傷組小鼠肺泡結構破壞、塌陷甚至消失，肺泡隔明顯增寬且肺泡隔內有大量炎性細胞浸潤；姜黃素干預組小鼠部分肺泡腔融合消失，部分肺泡腔可見出血、滲出及少量炎性細胞浸潤；TLR4 激動劑組小鼠肺泡擴張融合、炎性細胞滲出較嚴重；TLR4 抑制劑組小鼠肺泡結構相對比較完整，肺泡壁較薄，肺泡腔輪廓較清晰，炎性細胞滲出和炎癥浸潤則較輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態（HE，×400）Fig.1 Pathological morphologies of mouse lung tissues in various groups（HE，×400）

與對照組比較，急性肺損傷組小鼠肺組織病理學評分顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預組評分顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預組比較，TLR4 激動劑組評分顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組評分明顯降低（P＜0.01）。見表3。

4 討論

急性肺損傷是現代危重病醫學的重大難題，主要表現為急性呼吸困難和頑固性低氧血癥［10］，其最突出的特點是因過度炎癥反應引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、肺不張、毛細血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙。膿毒癥是臨床急性肺損傷最常見的病因之一，因此本研究采用常用的腹腔注射LPS 方法建立內毒素血癥導致急性肺損傷的小鼠模型，模擬臨床急性肺損傷的發生，并同時觀察TLR4／MyD88／NF-κB 信號通路在姜黃素改善急性肺損傷小鼠炎癥反應中的作用機制。

表3 各組肺組織病理學評分比較（±s， n=6）Tab.3 Comparison of pathological scores in lung tissues among various groups（±s， n=6）

表3 各組肺組織病理學評分比較（±s， n=6）Tab.3 Comparison of pathological scores in lung tissues among various groups（±s， n=6）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預組比較，＆＆P＜0.01.

TNF-α 是機體介導炎癥反應的關鍵細胞因子，也是急性肺損傷炎癥反應的一個較為客觀的指標［11］，釋放后可迅速激活肺組織中性粒細胞、肺泡巨噬細胞、內皮細胞和血小板等，進而誘導其他炎性因子的產生和釋放，發揮“級聯放大”的作用，不斷加重肺組織損傷［12-13］。在整個炎癥反應中，TNF-α 是始動因素，IL-1β 起協同作用［14-15］，后者雖不能直接活化炎性白細胞，但可刺激其他炎性因子（如IL-6、IL-8 等）的分泌，促進炎癥反應發展［16］。

Toll 樣受體家族是一類天然免疫受體，廣泛分布于機體淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，可通過識別病原微生物表面的配體-病原體相關分子模式（如G-菌的LPS），通過一系列信號通路介導炎癥介質釋放，在天然免疫防御中發揮重要作用［17-18］。TLR4 是目前Toll 樣受體研究中最多的一種，也是靶細胞上LPS 引發炎癥反應的主要配體，在內毒素性急性肺損傷 的發生發展中發揮重要作用。LPS可激活TLR4 通路，然后通過髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑介導多種炎性信號轉導，參與炎性反應，以誘導下游的NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶的早期相活化為特征，主要介導炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）產生［19-20］。

本研究發現，LPS 致急性肺損傷小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著升高，肺組織病理損傷明顯增加、肺組織病理學評分升高；姜黃素干預可顯著降低急性肺損傷小鼠炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 等）水平，減輕肺組織病理損傷，降低肺組織病理學評分。本研究還證實，急性肺損傷小鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平均明顯升高，而姜黃素可顯著降低三者水平，這與炎性細胞和炎癥因子的表達變化趨勢基本一致，提示姜黃素可能通過抑制TLR4 受體的表達，序貫影響TLR4／MyD88／NF-κB 信號通路，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 釋放，從而顯著改善LPS 導致的小鼠急性肺損傷。

綜上所述，本實驗為急性肺損傷的預防提供了理論和實驗依據，姜黃素有望成為相關新型藥物。然而，本研究觀察指標有限，姜黃素在生物體內的穩定性、利用率、毒副作用如何，以及能否在臨床展開試驗尚不明確，有待將來進一步研究。