健脾清化方對AngⅡ刺激下大鼠系膜細胞NADPH／p38MAPK 氧化應激通路的影響

鄒 赟，何立群?

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海 201203；2.上海中醫藥大學中醫腎病研究所，上海 201203；3.上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203）

健脾清化方是由何立群教授根據李東垣脾胃學說中“火與元氣不兩立，一勝則一負，脾胃氣虛則下流于腎，陰火得以乘土位”的主要學術理論所制，其補虛之外清熱燥濕之功尤著，切中慢性腎衰與濕熱密不可分的密切關系，在長期的臨床應用中已被證明具有顯著改善腎功能的作用［1］。在前期的體內實驗中證實，健脾清化方干預可顯著下調了AT1／NADPH／p38MAPK 氧化應激通路的活化狀態，從而有效減少了炎癥因子的分泌，為其顯著的臨床療效提供了實驗依據［2］。本研究從體外實驗的角度培養大鼠系膜細胞（MCs），觀察其在AngⅡ的刺激下NADPH／p38MAPK 信號轉導通路的活化，活性氧標志物MDA、SOD 的表達，以及健脾清化方的干預作用，旨在進一步從細胞水平驗證該方改善慢性腎衰大鼠氧化應激可能的作用途徑。

1 材料

1.1 動物、細胞株 正常大鼠腎臟系膜細胞株（HBZY-1）購自上海復盟基因生物科技有限公司。健康成年雄性SD 大鼠（SPF 級），8 周齡，體質量（200±20）g，由上海西普爾-必凱實驗有限公司提供［SCXX（滬）2013-0016］，共12 只，分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，25 ℃、12 h 光照、45%相對濕度的環境中，自由飲水，喂以標準普通飼料。

1.2 試藥 氯沙坦鉀片，100 mg／片（杭州默沙東制藥有限公司，批號100395）。胎牛血清（FBS）、MEM 細胞培養基（美國Gibco 公司）；AngII、胰蛋白酶（美國Sigma 公司）；Trizol 法總RNA 抽提試劑盒、cDNA 第一條鏈反轉錄試劑盒、SYBR real-time 試劑盒（瑞士Roche 公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）；p-p38MAPK 多克隆抗體（美國CST 公司）；β-actin、二抗羊抗兔IgG（美國Santa Cruse）；ECL 化學發光試劑盒（美國密理博公司）；乙二胺四乙酸EDTA（法國Biowest 公司）。

2 方法

2.1 健脾清化方水煎劑制備 組方藥材黨參15 g、生黃芪15 g、草果仁6 g、蒼術10 g、黃連3 g、制大黃9 g，共計58 g，由上海中醫藥大學中藥研究所提供，水煎濃縮為生藥量0.58 g／mL。

2.2 含藥血清的制備 12 只SD 大鼠隨機分為正常組、健脾清化方組、氯沙坦組，每組4 只，氯沙坦鉀片研成細粉，用生理鹽水配成1 mg／mL 的混懸液。健脾清化方組按5.8 g／kg 灌胃，氯沙坦組按10 mg／kg 灌胃，用藥劑量按人體（70 kg 體質量）每公斤體質量用藥量6 倍進行換算，1 次／d，共3 d；正常組同體積生理鹽水灌胃。末次給藥后2 h 腹主動脈取血，冷凍離心機3 000 r／mim 離心10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，放入-80 ℃低溫冰箱凍存。

2.3 細胞分組及給藥 大鼠腎小球系膜細胞株常規培養于含10%胎牛血清的MEM 培養基中，培養條件為溫度37 ℃，飽和濕度5% CO2，每2～3 d 用含0.05% EDTA 的胰酶消化傳代，傳代后第3～5代的細胞用于實驗。取對數生長期的系膜細胞，0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的MEM 培養液制成單細胞懸液，接種于6 孔無菌培養板，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度下培養，待系膜細胞生長至80%融合，改用無血清培養液靜置孵育24 h使細胞生長同步。細胞分組為①10%大鼠正常血清組，給予10%正常大鼠血清；②10%健脾清化方含藥血清組，給予10%健脾清化方含藥血清；③10%氯沙坦含藥血清組，給予10% 氯沙坦含藥血清；④10% 正常大鼠血清+Ang Ⅱ組，同時給予100 nmol／L AngⅡ和10%正常大鼠血清；⑤10%健脾清化方含藥血清+AngⅡ組，同時給予100 nmol／L AngⅡ和10%健脾清化方含藥血清；⑥10%氯沙坦含藥血清+Ang Ⅱ組，同 時 給 予100 nmol／L Ang Ⅱ和10%氯沙坦含藥血清，培養24 h。棄去培養基上清，用預冷的PBS 洗滌細胞1～2 次，用細胞刮刮下細胞，冰水浴超聲裂解以充分破壞細胞，使其釋放出細胞內成分，超聲結束后離心收集上清，-70 ℃低溫冰箱中保存。

2.4 檢測不同時間點Ang Ⅱ刺激下系膜細胞p47phoxmRNA 表達 將系膜細胞傳到培養板中，加入100 nmol／L Ang Ⅱ，分別處理不同時間（30 min、4 h、8 h、12 h、24 h）后收取細胞，Trizol 法提取大鼠腎小球系膜細胞總RNA，反轉錄成cDNA，采用RT-PCR 法檢測系膜細胞在AngⅡ刺激下不同時間點p47phoxmRNA 表達，并在保證實驗效果和穩定性的前提下，以表達量最高峰時對應的時間點作為后續各項指標的檢測時間點。p47phoxmRNA 基因引物序列見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

PCR 反應程序為95 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環，計算p47phox和β-actin的Ct值（基因擴增到超過熒光最低檢測水平的循環數），cDNA 的擴增倍數用β-actin作為校正基因，mRNA 表達的相對水平使用livak 法計算。每個樣品做3 個復孔，取平均值。

2.5 檢測各組含藥血清對系膜細胞p47phoxmRNA表達的影響 采用RT-PCR 法。按“2.3”項下方法處理各組細胞，檢測各組系膜細胞p47phoxmRNA 表達。每組均設3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.6 檢測各組含藥血清對系膜細胞MDA、SOD 水平的影響 采用化學發光法。按“2.3”項下方法處理各組細胞，根據試劑盒說明書步驟操作，計算MDA、SOD 水平。每組均設3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.7 檢測各組含藥血清對系膜細胞p-p38MAPK 水平的影響 采用Western blot 法。按“2.3”項下方法處理各組細胞，BCA 蛋白定量法測定各組蛋白質濃度。經8% SDS-PAGE 電泳分離蛋白質，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF 膜上，膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，TBS-T 洗膜3 次，5 min／次，然后加入一抗4 ℃孵育過夜，次日TBS-T 洗膜洗3次，5 min／次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBS-T 洗膜后加入化學發光試劑曝光，用凝膠圖像分析系統掃描分析條帶的面積和灰度，蛋白區帶用積分灰度值表達，以β-actin 作為對照。每組均設3 個樣品，每個樣品測定2 次。

2.8 統計學分析 應用SPSS 15.0 軟件進行處理，計量數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 AngⅡ刺激下系膜細胞不同時間點p47phoxmRNA 表達 100 nmol／L Ang Ⅱ分別于0 min、30 min、4 h、8 h、12 h、24 h 處理系膜細胞，發現p47phoxmRNA 表達呈時間依賴性升高，0 min時最低（1.00±0.17），24 h 時最高（4.75±0.40）。

3.2 各組含藥血清對系膜細胞p47phoxmRNA 表達的影響 如表2 所示，與10%正常大鼠血清組比較，10%正常大鼠血清+AngⅡ組p47phoxmRNA 表達顯著升高（P＜0.01）；與10% 正常大鼠血清+AngⅡ組比較，10%健脾清化方+AngⅡ組、10%氯沙坦+Ang Ⅱ組明顯降低了p47phoxmRNA 表達（P＜0.01）。

3.3 各組含藥血清對系膜細胞MDA、SOD 水平的影響 如表3 所示，與10%大鼠正常血清組比較，10%大鼠正常血清+AngⅡ組SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，10% 健脾清化方+AngⅡ組、10%氯沙坦+AngⅡ組能明顯上調SOD 水平，下調MDA 水平（P＜0.01）。

表2 各組含藥血清對系膜細胞p47phox mRNA 表達的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of medicated serum on MCs p47phox mRNA expression of each group（±s， n=3）

表2 各組含藥血清對系膜細胞p47phox mRNA 表達的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of medicated serum on MCs p47phox mRNA expression of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

表3 各組含藥血清對系膜細胞MDA、SOD 水平的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of medicated serum on MCs MDA，SOD levels of each group（±s， n=3）

表3 各組含藥血清對系膜細胞MDA、SOD 水平的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of medicated serum on MCs MDA，SOD levels of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

3.4 各組含藥血清對系膜細胞p-p38MAPK 蛋白表達的影響 如圖1、表4 所示，與10%大鼠正常血清組比較，10% 大鼠正常血清+Ang Ⅱ組p-P38MAPK 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，10% 健脾清化方+AngⅡ組、10% 氯沙坦+AngⅡ組p-P38MAPK 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組含藥血清對p-p38MAPK 蛋白表達的影響Fig.1 Effects of medicated serum on p-p38MAPK protein expression of each group

表4 各組含藥血清對p-p38MAPK 蛋白表達的影響（±s， n=3）Tab.4 Effects of medicated serum on p-p38MAPK protein expression of each group（±s， n=3）

注：與10%大鼠正常血清組比較，??P＜0.01；與10%大鼠正常血清+AngⅡ組比較，＃＃P＜0.01

4 討論

腎小球系膜細胞（MCs）是腎小球中最具有活性的固有細胞［3］，體外實驗已經證明其增殖和細胞外基質的增加幾乎是所有呈慢性進行性發展的腎臟疾病一個最主要的組織學特征［4-5］。因此，這部分體外實驗選取系膜細胞為研究對象，模擬慢性腎衰的共同病變過程-腎纖維化的病理變化過程進行研究。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統（RAS）的主要活性肽產物［6］，有研究發現，它還與腎小球系膜細胞增殖肥大以及細胞外基質的產生有關，而這些均是導致腎小球硬化的關鍵因素［7］，眾多實驗顯示其機制可能與促炎性反應和氧化應激有關［8］。Lv 等［9］報道，AngⅡ介導了系膜細胞的凋亡和細胞內ROS 的產生，而AT1R 拮抗劑坎地沙坦可抑制這個過程，具有抗凋亡和抗氧化作用。作為NADH／NADPH 氧化酶重要的刺激因子［10］，AngⅡ可以誘導血管平滑肌細胞、內皮細胞和腎小管上皮細胞等產生過多的ROS，啟動氧化應激反應［11］。

體外實驗顯示，AngⅡ刺激后腎小球系膜細胞內NADPH 氧化酶亞基p47phoxmRNA 的表達與刺激時間呈正相關，至24 h 達峰值，且表達穩定，故在隨后的指標觀察中均選擇24 h 這個時間點進行觀察。10% 大鼠正常血清加入Ang Ⅱ刺激后p47phox表達顯著升高，提示NADPH 介導的氧化應激途徑由AngⅡ誘發而迅速活化，10%大鼠正常血清+AngⅡ組與10%健脾清化+AngⅡ組、10%氯沙坦+AngⅡ組的比較顯示，健脾清化方和科素亞的干預能顯著減少p47phoxmRNA 的表達。表2 說明，健脾清化方能有效調控腎小球MCs 氧化應激反應中重要環節NADPH 氧化酶亞基p47phoxmRNA 的表達，從而減輕氧化應激反應。ROS 是氧化應激反應的核心環節，通過檢測SOD 和MDA 這2 種氧化應激標志物來反映ROS 的表達情況。由表3 可知，大鼠正常血清加入AngⅡ培養后系膜細胞內氧化與抗氧化平衡被打破，SOD 的顯著下降顯示存在抗氧化防御能力的代償不足，最終導致了氧化應激發生，生物膜的脂質過氧化增加，使MDA大量生成，兩者與正常血清組差異明顯（P＜0.01）并呈氧化應激狀態；加入藥物干預后，無論是健脾清化方還是氯沙坦，都能明顯降低MDA 水平，提高SOD 水平，與前期的體內實驗結果完全一致。

已有研究發現［12］，在血管緊張素Ⅱ的刺激下，由NADPH 氧化酶介導的氧化應激產生過量ROS，后者又是誘導MAPKs 磷酸化、活化MAPK 信號通路的重要因素。此次研究也發現（表4），正常大鼠血清加入AngⅡ后p-p38MAPK 表達量顯著升高，推測氧化應激可能與炎癥因子相關，與p38 的信號通路激活也密不可分，與前期報道一致。健脾清化方和氯沙坦干預后，磷酸化p38 表達明顯下降（P＜0.01），說明兩者均能明顯抑制系膜細胞p38MAPK 信號轉導通路的磷酸化。

本研究證實，AngⅡ可以上調腎小球系膜細胞NADPH 氧化酶亞基p47phox基因和刺激細胞內ROS 的生成，活化p38MAP 信號轉導通路，健脾清化方和AT1R 拮抗劑氯沙坦干預后能夠明顯抑制上述氧化反應，并抑制繼而發生的p38 信號轉導通路磷酸化，進一步從細胞水平驗證了氧化應激在慢性腎衰發病中的作用機制以及健脾清化方臨床取效的作用途徑，提示AngⅡ可能部分通過誘導細胞內NADPH 介導的ROS 產生，激活p38 信號轉導通路，促進腎小球系膜細胞表達下游炎癥因子，從而引起腎小球系膜基質增生和系膜區增寬，最終導致腎小球纖維化、腎功能衰竭，而健脾清化方治療對于氧化應激的改善作用可能有助于延緩慢性腎衰的發生發展進程。鑒于中藥多層次多靶點的治療特色，今后可考慮從其他氧化應激通路和炎癥信號轉導通路，以及各信號通路之間的相互關系進行更為深入的研究。