丹參總酚酸滴丸的制備及質量評價

何銀舟，胡正明，潘 旻，嵇 晶，程建明?

（1.淮安市淮安醫院，江蘇 淮安 223001；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

丹參為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是臨床上較為常用的中藥，在治療心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化等方面的應用日益廣泛［1-3］。大量藥理研究表明［4-6］，丹參水溶性成分丹酚酸可用于心腦血管疾病的治療，已成功研發出了注射用丹參多酚酸、多酚酸鹽等相關制劑，臨床療效良好，目前以注射劑為主，雖然起效迅速，生物利用度較高，但也存在給藥不方便、患者順應性差的問題，同時直接入血，對生產工藝要求高，一旦出現質量問題將引起嚴重的不良反應，而且該類成分吸收消除快，無法維持長時間較高血藥濃度，也導致相關注射劑只適合臨床急救。目前，丹參總酚酸常用劑型主要有顆粒劑、片劑、脂質體、滴丸、磷脂復合物等，但由于該類成分大多不耐熱，給相關生產工藝帶來了難度。

滴丸是指將固體或液體藥物與適當基質加熱熔化混勻后，滴入不相混溶的冷凝液中，收縮冷凝而成的小丸狀制劑［7-8］，具有生產工藝簡單、生物利用度高、起效迅速、穩定性好的特點，發展前景廣闊。因此，本實驗以丹酚酸中主要活性物質丹酚酸B、迷迭香酸為指標，對丹參總酚酸滴丸制備工藝和質量標準進行研究，以期為該類成分深入研究和相關制劑開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器 滴丸機由南京中醫藥大學藥學院中藥藥劑教研室提供；Waters E2695 高效液相色譜儀，配置Waters 2489 UV 檢測器（美國Waters 公司）；BT125D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；DW-2 型調溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠）；FA2004 型電子分析天平（上海上平儀器有限公司）；YP6002 型電子天平（上海光正醫療儀器有限公司）；Unique-s15 型超純水系統（北京佰億新創科技有限公司）。

1.2 試藥 丹參總酚酸中間體（自制，批號20170304）。液體石蠟、二甲基硅油（上海泰坦科技股份有限公司）；聚乙二醇4000、聚乙二醇6000（無錫市亞泰聯合化工有限公司，批號20170301）。丹酚酸 B（含有量98%，批號Y26O7H23683）、迷迭香酸對照品（含有量98%，批號P26A7F13802）（上海源葉生物科技有限公司）。毛細管（華西醫科大學儀器廠）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。甲醇（美國賽默飛世爾科技公司，批號LOT18055159）、乙腈（德國默克公司，AS1122-801），以及磷酸（批號D629033）、冰醋酸（批號E1702076）［阿拉丁試劑（上海）有限公司］均為色譜純；乙酸乙酯（批號 14061411310 ）、三氯化鐵（批號14071210994）、鐵氰化鉀（批號15100210410）、鹽酸（批號160912100825）（南京化學試劑有限公司）；甲酸（批號10014128，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 滴丸制備工藝

2.1.1 冷卻劑種類 固定藥物與基質配比1∶5，取丹參總酚酸凍干粉1.5 g，加入混合基質7.5 g（PEG4000∶PEG6000=4∶1），65 ℃水浴熔融并攪拌混勻，80 ℃下分別滴入二甲基硅油、液體石蠟中，以滴丸下降速度、成型情況為指標考察冷卻劑。結果，二甲基硅油處理時滴丸下降速度合適，丸形規則圓整；液體石蠟處理時滴丸下降速度過快，部分帶有小尾巴，可能與其密度較小有關，故選擇前者作為冷卻劑。

2.1.2 基質配比 PEG4000 具有良好的分散力及較大的內聚力，符合滴丸對基質的要求，再加入一定比例黏度較大的PEG6000 以調整基質成型。兩者按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 比例混合熔融后滴入二甲基硅油中，制備空白滴丸，以易滴程度、空白滴丸成型情況為指標進行篩選，結果見表1。由表可知，隨著PEG4000 比例增大滴速變快，不易控制；當 PEG4000、PEG6000 比例為3∶1 時，基質較易滴出，而且空白滴丸成型性較好，滴丸圓整，硬度適宜，故選擇其作為基質。

表1 基質配比考察結果Tab.1 Results of matrix ratio investigation

2.1.3 藥物與基質配比 滴丸中藥物與基質的配比一般在1∶1～1∶10 范圍內，但其過高時易導致滴丸成型困難，而過低時又會使載藥量偏低，故在1∶1～1∶6 范圍內進行考察，結果見表2。由表可知，1∶5 時效果最理想，故選擇其作為藥物與基質配比。

表2 藥物與基質配比考察結果Tab.2 Results of drug-matrix ratio investigation

2.1.4 滴距、滴速 滴距過小時，液滴到達二甲基硅油中后來不及收縮，導致滴丸不圓整；滴距過大時，液滴容易呈扁形，或者因重力作用而被跌散生小丸［9］，本實驗篩選空白滴丸時發現，滴距為6 cm時滴丸圓整度較好。滴速過快時，滴丸連續下沉到冷卻劑中，容易相互粘連，圓整度不佳；滴速過慢時，雖然滴丸圓整度好，成型性符合要求，但混合基質易凝固，導致滴口堵塞，并且容易增加丸重差異，從而影響滴丸質量，本實驗在不影響成型效果、圓整度的情況下適度提高滴速，控制在60 滴／min。

2.1.5 料溫 料溫過低時，滴丸易出現拖尾現象，圓整度差；料溫過高時，滴丸圓整度降低，若滴制過快則易粘連。本實驗發現，混合基質在58 ℃時開始熔融，65 ℃時全部熔融，由于丹酚酸類成分高溫不穩定，故選擇65 ℃作為料溫。

2.1.6 其他滴制條件 根據滴丸成型性和圓整度，確定冷卻劑溫度為上常溫下低溫，滴口內、外徑為3、4.5 mm。

2.1.7 工藝驗證 根據上述優化工藝參數，制備3 批滴丸（批號20170410、20170411、20170412），發現其丸形圓整，色澤均一，硬度較好，無拖尾、粘連現象，表明工藝穩定可行。

2.2 滴丸質量評價

2.2.1 HPLC 法測定丹酚酸B、迷迭香酸含有量

2.2.1.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-1%醋酸（B），梯度洗脫，程序見表3；體積流量1.0 mL／min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B 對照品4.85 mg、迷迭香酸對照品3.80 mg，分別置于25、250 mL 棕色量瓶中，80%甲醇稀釋，即得（190.12、14.90 μg／mL）。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution programs

2.2.1.3 供試品溶液制備 取滴丸10 粒，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密稱定質量，加入50 mL 80% 甲醇，超聲（功率140 W、頻率42 kHz）20 min，放冷，80% 甲醇補足減失的質量，濾過，即得。

2.2.1.4 專屬性考察 取空白滴丸、含藥滴丸適量，按“2.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由表可知，PEG4000、PEG6000 對測定無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of various constituents

2.2.1.5 線性關系考察 精密量取190.12 μg／mL丹酚酸B 對照品溶液、14.90 μg／mL 迷迭香酸對照品溶液各1、2、4、6、8、10 mL，80% 甲醇定容至10 mL，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得到丹酚酸B、迷迭香酸方程分別為Y=6 216.4X-1 019.6（R2=0.999 66）、Y=10 996X-153.46（R2=0.999 8），分別在19.01～190.12、1.49～14.90 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.1.6 精密度試驗 取152.10 μg／mL 丹酚酸B對照品溶液、8.94 μg／mL 迷迭香酸對照品溶液適量，在“2.2.2.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得丹酚酸B、迷迭香酸峰面積RSD 分別為0.88%、1.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.7 重復性試驗 取同一批滴丸，按“2.2.2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得丹酚酸B、迷迭香酸含有量RSD 分別為1.72%、1.17%，表明該方法重復性良好。

2.2.1.8 穩定性試驗 取同一批滴丸，按“2.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2.1”項色譜條件下于0、3、6、9、12、24 h進樣測定，測得丹酚酸B、迷迭香酸含有量RSD 分別為1.72%、1.17%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。

2.2.1.9 加樣回收率實驗 分別取同一批滴丸25、100 粒，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入相當于滴丸中成分含有量80%、100%、120%的對照品后進行提取，取續濾液，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，丹酚酸B、迷迭香酸平均加樣回收率分別為 97.92%、96.58%，RSD 分別為2.45%、1.64%。

2.2.1.10 樣品含有量測定 取3 批滴丸，按“2.2.2.3”項下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。以平均值的-20% 為下限，初步確定丹酚酸B、迷迭香酸含有量分別不得低于5.45%、0.46%。

表4 各成分含有量測定結果（n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n=3）

2.2.2 TLC 法定性鑒別

2.2.2.1 供試品溶液制備 取滴丸15 丸，加水1 mL、稀鹽酸2 滴，充分振搖，再加乙酸乙酯3 mL振搖1 min，離心2 min，上清液蒸干至2 mL，即得。

2.2.2.2 對照藥材溶液制備 取丹參對照藥材，按“2.2.2.1”項下方法制備，即得。

2.2.2.3 展開條件 硅膠G 薄層板；展開劑乙酸乙酯-水-甲酸（14∶2∶3）上層溶液；顯色劑1%三氯化鐵-1% 鐵氰化鉀（1∶1）溶液，臨用時配制。

2.2.2.4 鑒別方法 取3 批滴丸，按“2.2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照2015 年版《中國藥典》薄層色譜法（通則0502）試驗，結果見圖2。

圖2 各成分TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of various constituents

2.2.3 重量差異限度檢查 精密稱取滴丸20 粒，計算其總重和每粒丸重，根據2015 年版《中國藥典》一部附錄判斷重量差異是否符合要求。結果，20 粒 滴 丸 丸 重 分 別 為25.56、25.51、25.43、25.57、25.48、25.48、25.43、25.49、25.51、25.54、25.39、25.55、25.62、25.58、25.53、25.53、25.61、25.47、25.45、25.51 mg，平 均25.51 mg＜0.03 g，RSD 為0.24%。藥典規定，重量差異限度應±15%，每粒滴丸丸重應在21.68～29.33 mg 范圍內，超出標準限度的不得多于2 丸，不得有1 丸超出標準限度的1 倍，由此可知，本實驗所制滴丸符合相關要求。

2.2.4 溶散時限檢查 取6 粒滴丸于溶出儀的吊籃中，溫度設定為37 ℃，發現所有滴丸在5 min內均完全溶解，符合2015 年版《中國藥典》一部滴丸劑項下溶散時限不得超過30 min 的規定。

3 討論

目前，丹酚酸類成分的緩控釋制劑仍處于實驗室階段，未見市售產品。張麗紅等［10］以大豆卵磷脂制備丹參總酚酸長循環脂質體，發現它可減緩丹酚酸在體內的消除，延長體內滯留時間，提高生物利用度；咸銀庫等［11］以丹參總酚酸為原料制備速釋的口腔崩解片，可提高生物利用度；Jin 等［12］通過制備丹參總酚酸磷脂復合物，改善了脂溶性差的問題；此外，也有關于丹參總酚酸滴丸、胃滯留緩釋片的報道［13-15］，為相關制劑研究提供了參考。

本實驗以滴丸成型性和圓整度為依據，考察了冷卻劑、基質配比、藥物與基質配比等影響滴丸成型工藝的因素，最終確定最優工藝為將丹參總酚酸凍干粉研細混勻備用，以PEG4000、PEG6000 為成型基質，按3∶1 比例混合，65 ℃水浴加熱熔融，按藥物與基質配比1∶5 分次加入凍干粉，攪拌均勻，在滴距6 cm，滴口內、外徑3、4.5 mm，滴速60 滴／min 的條件下滴入二甲基硅油冷凝劑（上常溫下低溫）中，冷卻，固化成丸，取出，濾紙吸干表面冷卻劑，即得，所得滴丸外觀圓整、硬度適宜，制備工藝合理可行。其中，丹酚酸B、迷迭香酸平均含有量分別為6.81%、0.58%，平均丸重為25.51 mg，重量差異限度、溶散時限均符合藥典要求。由此可知，該工藝操作簡單，生物利用度高，起效迅速，穩定性好，具有廣闊的發展前景，可為丹參酚酸類成分研究和相關制劑開發提供參考。