復方丹參滴丸在大鼠體內代謝產物的分析

郭洪梅，蘇振宇，高詩凱，杜 巖，季 帥，湯道權?

（1.徐州醫科大學附屬市立醫院，江蘇 徐州 221004；2.徐州市第一人民醫院，江蘇 徐州 221004；3.徐州醫科大學藥學院，江蘇 徐州 221004）

復方丹參滴丸由丹參、三七、冰片3 味藥材組成，臨床上主要用于冠心病、高血脂等心血管疾病的治療，同時在腦梗死、肝纖維化、慢性肺心病等疾病中也表現出較好的療效［1］，丹參酮、酚酸、三萜皂苷是其主要成分［2］。目前，關于復方丹參滴丸化學成分和質量控制的研究已有大量報道，但其藥效物質基礎仍不明確，對于這個含有成百上千種成分的中藥復方而言，能被吸收入血的才有可能是真正發揮作用的。因此，研究復方丹參滴丸口服給藥后血液中代謝產物，是闡明其活性物質基礎，以及其配伍原理和作用機制的重要環節［3］。

近年來，對復方丹參滴丸單味藥（丹參或三七）或其所含單體成分（丹參素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸A 等）的代謝研究較多，已有多位學者進行了報道［4-6］。然而，中藥是一個復雜體系，由于化合物之間的相互作用，導致這些單味藥或單體成分各自的代謝輪廓并不能代表在復方中的代謝情況。目前，關于復方丹參滴丸全方的代謝研究較少，僅有的幾篇大多是針對其中少數幾種主要成分［7-8］，不能代表整個復方，而且尚無對其入血成分全面的分析鑒定。

隨著液質聯用技術的不斷發展，其快速、高效、準確的特點在體內外復雜成分分析方面有著明顯優勢，逐漸成為中藥體內代謝研究的有效手段［6］。本實驗采用超高效液相色譜和四極桿飛行時間質譜（UPLC-qTOF／MS）法，對復方丹參滴丸灌胃大鼠后的入血成分進行鑒定，為該復方藥效物質基礎研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC 色譜儀、Agilent 6550 qTOF 質譜儀（美國Agilent 公司）；XW-80A微型渦旋儀（上海滬西分析儀器廠）；AB265-S 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；5417R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 試藥 復方丹參滴丸（天津天士力制藥集團有限公司）。丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、阿魏酸、原人參二醇、咖啡酸、丹酚酸A、人參皂苷Rg1對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；原兒茶酸、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、原兒茶醛、迷迭香酸對照品（上海阿拉丁試劑有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純（美國MREDA 公司）。

1.3 動物 清潔級雄性SD 大鼠，體質量（250±20）g，購于徐州醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK2018-0016。大鼠飼養于徐州醫科大學實驗動物中心，室內溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，明暗12／12 h。

2 方法

2.1 藥物混懸液制備 精密量取滴丸3 429 mg，研磨后轉移至50 mL 量瓶中，生理鹽水定容至刻度，超聲10 min，即得（68.58 mg／mL）。

2.2 生物樣品采集及處理 15 只大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，按275 mg／kg 劑量（相當于臨床劑量的4 倍）灌胃給予混懸液，每天1 次，連續21 d，最后1 次給藥后0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 眼底靜脈叢取血各0.4 mL，置于肝素處理的離心管中，3 000 r／min離心10 min，上清液合并，加4 倍量甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻30 s，12 000 r／min 離心10 min，上清液氮氣吹干，殘渣用100 μL 甲醇復溶，渦旋30 s，0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取丹參素、阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛、原兒茶酸、三七皂苷R1，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、原人參二醇、丹參酮ⅡA、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ對照品適量，甲醇溶解定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得，。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜 Poroshell 120 SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相乙腈-水（含0.1% 甲酸）；梯度洗脫（0～1 min，10%～15% 乙腈；1～5 min，15%～28% 乙腈；5～12 min，28%～30% 乙腈；12～17 min，30%～65% 乙 腈；17～25 min，65%～66%乙腈；25～30 min，66%～80%乙腈；30～35 min，80%～90%乙腈）；柱溫35 ℃；體積流量0.2 mL／min；進樣量2 μL。

2.4.2 質譜 ESI 電噴霧離子源；正負離子掃描模式；干燥氣溫度200 ℃，體積流量14 L／min；毛細管電壓3.5 kV；霧化器壓力35 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度275 ℃，體積流量11 L／min；碎裂器電壓135 V；碰撞能量10～30 eV。

3 結果

3.1 UPLC-qTOF／MS 分析 總離子流圖見圖1，通過MassHunter 軟件中的EIC Manager、Formula Calculator、Mass Calculator、消除背景峰等數據處理功能，結合相應對照品及參考文獻中的保留時間，一級、二級質譜信號，共分析得到85 種入血成分，其中原型成分23 種，代謝產物62 種，具體見表1～2；負離子模式下檢測到59 種，主要包括酚酸、三萜皂苷類及其代謝產物；正離子模式下檢測到26 種，主要包括丹參酮及其代謝產物，其中3 種為首次報道。在23 種原型成分中，15 種結構與對照品比對后得到確認，分別是原兒茶酸（7）、阿魏酸（9）、原兒茶醛（11）、咖啡酸（13）、丹酚酸A（27）、丹參素（29）、三七皂苷R1（30）、丹酚酸B（36）、迷迭香酸（39）、人參皂苷Rb1（49）、原人參二醇（54）、人參皂苷Rg1（55）、二氫丹參酮Ⅰ（79）、丹參酮Ⅰ（81）、丹參酮ⅡA（83）。

圖1 樣品總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of samples

3.2 酚酸及其代謝產物鑒定 表1 顯示，灌胃給藥后在血漿中檢測到咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸D、阿魏酸、丹參素、丹酚酸A、原兒茶酸、丹酚酸B、原兒茶醛、異阿魏酸10 種酚酸類成分原型及其代謝產物，其中8 種結構與對照品比對后得到確認，同時檢測到丹參中的一種微量成分丹酚酸F的原型，其一相代謝方式主要為甲基化、羥基化，偶爾發生水解、去羥基化等反應；二相代謝方式主要為葡萄糖醛酸化、硫酸酯化，偶爾產生甘氨酸結合物。下面以丹參素為例，介紹其代謝過程及產物鑒定方法。

表1 大鼠血漿中代謝產物（負離子模式）Tab.1 Metabolites in rat plasma（negative ion mode）

表2 大鼠血漿中代謝產物（正離子模式）Tab.2 Metabolites in rat plasma（positive ion mode）

本實驗中除了檢測到丹參素（29）原型外，還檢測到其4 個代謝產物，分別為甲基丹參素硫酸鹽（5）、丹參素硫酸鹽（15）、羥基丹參素（23）、甲基丹參素葡萄糖醛酸（37）。其中，29的［M-H］-分子離子峰是m／z197.045 6，表明分子式為C9H10O5，二級質譜顯示一個主要的碎片離子為m／z135.255 9，是丹參素分子失去一個羧基（-CO2）、一分子水（-H2O）后的特征碎片，其保留時間與質譜信息、對照品完全一致，確認為丹參素；23 的［M-H］-分子離子峰是m／z213.041 6，表明分子式為C9H10O6，比丹參素多一個氧原子，在二級質譜中脫去一個羥基產生m／z196.961 0（對應于丹參素的分子離子峰），同時產生丹參素特征碎片離子m／z135.317 2，與文獻［9］報道一致，故鑒定為羥基丹參素；15 的［M-H］-分子離子峰是m／z277.002 0，表明分子式為C9H10O8S，比丹參素分子量多了80 Da，二級質譜顯示一個脫去硫酸鹽（-SO3）的特征碎片m／z197.130 2（對應丹參素分子離子峰），同時也可觀察到丹參素特征碎片離子m／z135.080 4，與文獻［10］報道一致，故鑒定為丹參素硫酸鹽；5 的［M-H］-分子離子峰是m／z291.019 3，表明分子式為C10H12O8S，在二級質譜圖中脫去一個SO3分子而產生硫酸鹽特征碎片m／z211.028 0，同時可進一步脫去甲基（-14 Da）而產生m／z196.961 0（對應于丹參素分子離子峰），故鑒定為甲基丹參素硫酸鹽；37 的［M-H］-分子離子峰是m／z387.091 7，表明分子式為C18H20O11，在二級質譜圖中失去176 Da，表明是一個葡萄糖醛酸化產物，產生的碎片離子m／z211.125 6 與甲基丹參素相同，同時可發生與丹參素相同的裂解（丟失一個羧基、一分子水）而產生m／z148.966 0，與文獻［9］報道一致，故鑒定為甲基丹參素葡萄糖醛酸。MS／MS 譜圖見圖2。

圖2 各成分MS／MS 譜圖Fig.2 MS／MS spectra for various constituents

3.3 三萜皂苷及其代謝產物鑒定 灌胃給藥后，僅在血漿中檢測到三七皂苷R1（30）、人參皂苷Rb1（49）、人參皂苷Rg1（55）、人參皂苷Rg2（56）4 個原型，其中3 個與對照品比對后得到確認，另外還檢測到1 個水解后的代謝產物原人參二醇，在負離子模式下有較好的質譜響應。其中，30的精確［M-H］-分子離子峰是m／z931.527 9，丟失一個木糖分子（-132 Da）而產生的m／z799.172 6 是其主要碎片；49 在負離子模式下可加上一分子甲酸而產生 ［M-H］-分子離子峰m／z1 107.593 0，可連續水解失去多個葡萄糖而產生碎片m／z621.568 2、皂苷元m／z458.950 5；55 的［M-H］-分子離子峰是m／z799.486 3，同樣可連續丟失2 個葡萄糖而產生m／z637.430 6、苷元m／z474.644 6；56 的 ［M-H］-分子離子峰是m／z783.490 1，表明分子式為C42H72O13，可丟失一分子葡萄糖、一分子鼠李糖而產生苷元m／z474.791 8。另外，原人參二醇（54）的［M-H］-分子離子峰是m／z459.382 0，在較高碰撞能量下可發生開環裂解而產生碎片m／z293.044 8、148.966 6，與文獻［5］報道一致，故鑒定為皂苷元原人參二醇［5］。

3.4 丹參酮及其代謝產物鑒定 灌胃給藥后，在血漿中檢測到26 種丹參酮，分別是丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、二氫丹參酮Ⅰ原型及其代謝產物，同時還發現含有量較低的丹參新醌A、丹參酸甲酯、紫丹參甲素A、丹參酮Ⅵ原型，其中3 個結構與對照品比對后得到確認。此外，3 個丹參酮類代謝產物，即丹參酮ⅡB硫酸鹽（65）、二羥基丹參酮ⅡA葡萄糖醛酸（66）、丹參酮ⅡA硫酸鹽（74）為首次報道。該類成分在體內的代謝轉化方式較多，主要包括一相代謝羥基化、呋喃環裂解、加氫還原、甲氧基化等反應，以及二相代謝的葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等，下面以丹參酮ⅡA為例，介紹其代謝轉化方式及產物鑒定方法。

化合物83 的高分辨［M+H］+分子離子峰是m／z295.132 9，表明分子式為C19H18O3，在二級質譜圖中可看到m／z276.851 6、249.134 4，是丹參酮ⅡA相繼丟失一分子H2O、一分子CO 后的特征碎片，其保留時間和質譜裂解方式與對照品完全一致，故鑒定為丹參酮ⅡA；化合物80 的［M+H］+分子離子峰是m／z471.162 3，表明分子式為C25H26O9，在二級質譜中丟失176 Da（葡萄糖醛酸單元）而產生m／z295.110 3，同時能進一步裂解產生丹參酮ⅡA的特征碎片m／z249.091 3，與文獻［17］報道一致，故鑒定為ⅡA 葡萄糖醛酸［17］；化合物74 推測為丹參酮ⅡA硫酸鹽，為首次報道；化合物75的［M+H］+分子離子峰是m／z311.127 4，分子式為C19H18O4，比丹參酮ⅡA多了一個氧原子，在二級質譜圖中有丟失H2O、CO 后的特征碎片m／z292.964 0、m／z249.149 8，根據文獻鑒定為羥基丹參酮ⅡA；化合物77 的［M+H］+分子離子峰是m／z327.120 3，表明分子式為C19H18O5，比丹參酮ⅡA多了兩個氧原子，在二級質譜圖中有連續丟失H2O、CO 后的特征碎片m／z311.743 3、277.120 9、264.961 5，與文獻［16］報道一致，故鑒定為二羥基丹參酮ⅡA；化合物66、70 的 ［M+H］+分子離子峰分別是m／z503.154 2、487.161 5，均可丟失一個葡萄糖醛酸單元（176 Da），根據所產生苷元的精確分子量和質譜裂解方式，鑒定兩者分別是二羥基丹參酮ⅡA葡萄糖醛酸、羥基丹參酮ⅡA葡萄糖醛酸［15］，其中前者為首次發現。

3.5 其他成分及其代謝產物鑒定 灌胃給藥后，在大鼠血漿中檢測到了含有量較高的丹參酮ⅡB（63），它一部分來自于原型成分吸收入血，而另一部分是由丹參酮ⅡA經羥基化后得到的代謝產物［15-16］，并且可進一步發生一相、二相代謝反應。本實驗共檢測到3 個與丹參酮ⅡB直接相關的代謝產物，分別是二羥基丹參酮ⅡB（67）、丹參酮ⅡB硫酸鹽（65）、丹參酮ⅡB葡萄糖醛酸（61）。鑒于此，丹參酮ⅡA的代謝途徑可歸納為圖3。

4 討論

UPLC-qTOF／MS 不僅具有分析速度快、選擇性強、準確度好、靈敏度高的特點，而且能提供豐富的碎片離子信息，精確鑒定代謝產物，已廣泛應用于生物樣品的體內代謝研究，故本實驗建立該方法分析大鼠灌胃復方丹參滴丸后血漿代謝產物。為了與臨床長期用藥保持一致，選擇連續灌胃21 d以使其體內代謝產物及其濃度變化達到穩態，考慮到不同代謝產物在體內的達峰時間有所差異，在最后1 次給藥后收集24 h 內不同時間點的血漿樣品，以期檢測到更多代謝產物，同時采用正負離子相結合的qTOF／MS 模式，使得不同類型化合物均有更強的質譜響應信號，從而提高了方法靈敏度。

圖3 丹參酮ⅡA可能的代謝途徑Fig.3 Possible metabolic pathways for tanshinoneⅡA

結果表明，復方丹參滴丸代謝產物主要來源于丹參中酚酸和丹參酮，以及三七中三萜皂苷類。其中，酚酸、丹參酮生物利用度較高，在體內可被廣泛檢測到，并能發生多種一相、二相代謝反應而生成多個代謝產物，以羥基化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化產物為主；三萜皂苷吸收較弱，僅在體內檢測到4 個原型和1 個代謝產物，進而證實丹參化合物是復方丹參滴丸主要入血成分。

通過查閱文獻發現，與大鼠灌胃單味藥（丹參或三七）或單體成分（丹參素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸A 等）比較，灌胃復方丹參滴丸后相關成分代謝產物可能會發生變化。例如，文獻報道給予丹參提取物后在血漿中可檢測到隱丹參酮及其代謝產物［4］，而本實驗僅檢測到隱丹參酮代謝產物，并未發現原型，其原因可能是復方丹參滴丸各單味藥之間的相互作用改變了相應藥物代謝酶活性，從而增加了隱丹參酮代謝，使其全部轉化為代謝產物；給予丹參素后在血漿中可檢測到代謝產物甲基丹參素［19］，而本實驗并未檢測到甲基丹參素，卻發現大量甲基丹參素硫酸鹽（5）和甲基丹參素葡萄糖醛酸（37），表明復方丹參滴丸其他組成藥物加速了甲基丹參素二相代謝。另外，代謝產物變化的原因還有可能是本實驗條件與文獻報道有所差異，具體還需作進一步研究。