金銀花總黃酮自微乳處方的優化

趙惠茹，石大玉，靖 會，肖 呈，周 喆，張一帆

（西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，為臨床常用中藥，具有疏散風熱、清熱解毒的功效［1］，其總黃酮有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抑菌、保肝等作用［2-3］，但其水溶性差，相關口服制劑（金銀花糖漿、復方金銀花顆粒等）生物利用度低，從而限制藥效發揮，影響臨床應用。文獻［4-6］報道，將金銀花總黃酮制成自微乳可能會提高其水溶性，但目前尚無相關研究。

自微乳是由油相、乳化劑、助乳化劑組成的一種新型藥物載體，在溫和攪拌下遇水可自乳化成粒徑小于100 nm 的水包油型乳劑，在增加難溶性藥物溶解度、促進藥物吸收、提高生物利用度、避免藥物水解和對胃腸道不良刺激方面具有明顯優勢，近年來已廣泛用于藥物制劑開發中［7-8］。其中，篩選處方是最核心的部分，故本實驗擬將金銀花總黃酮制成自微乳，并采用單純形網格法優化其處方，為相關新劑型研發提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ZEN3600 型激光粒度儀（英國Malvern公司）；UV762 型紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B 型電子精密天平（上海越平科學儀器有限公司）；TGL-16C型離心機（上海安亭科學儀器廠）；RE-2000A 型旋轉蒸發器、DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥 蘆丁對照品（含有量≥99%，批號100080，上海源葉生物科技有限公司）；金銀花總黃酮（批號180326，自制，以蘆丁計算含有量為74.6%）。金銀花購于西安市萬壽路藥材市場，經西安醫學院藥學院邊軍昌高級實驗師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾。D101 大孔吸附樹脂（陜西藍深科技有限公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40）、聚氧乙烯蓖麻油（EL-35）（德國巴斯夫公司）；曲拉通（X-100，成都市科龍化工試劑廠）；吐溫-80（天津富宇精細化工有限公司）；辛酸癸酸三甘油酯（上海千為油脂科技有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（國藥集團化學試劑有限公司）；油酸乙酯（天津市光復精細化工研究所）；聚乙二醇400（天津市科密歐化學試劑有限公司）；1，2-丙二醇（天津市北聯精細化學品開發有限公司）；異丙醇（天津市河東區紅巖試劑廠）。其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含有量測定［9］精密稱取蘆丁對照品20.0 mg，置于50 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定容，得0.400 mg／mL 對照品溶液，精密移取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，靜置6 min；10%硝酸鋁0.4 mL，搖勻，靜置6 min；4%氫氧化鈉4 mL，加水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，以相應試劑為空白對照，在510 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A=4.366 1X+0.011 3（r=0.997 1），在0.04～0.16 mg／mL范圍內線性關系良好。

2.2 總黃酮制備

2.2.1 提取［10］稱取藥材粗粉適量，置于索氏提取器中，石油醚連續回流至提取液無色后取出晾干，加入10、8、6 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，提取液合并，減壓濃縮至無醇味，6倍量蒸餾水攪拌溶解，12 h 后離心，上清液減壓濃縮至適當濃度，備用。

2.2.2 純化［11-12］將預處理好的D101 大孔吸附樹脂倒入燒杯中，加入總黃酮濃縮液靜態吸附12 h，將達到吸附飽和的樹脂裝入層析柱中，依次用6 BV 蒸餾水、5 BV 30%乙醇洗脫除去雜質，再用5 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，即得總黃酮。精密稱取干燥至恒重的總黃酮50 mg，置于25 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定，精密移取2.0 mL 置于25 mL 量瓶中，按“2.1”項下方法測定吸光度，測得總黃酮含有量為74.6%。

2.3 處方篩選

2.3.1 溶解度 精密稱取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH-40、曲拉通X-100、聚氧乙烯蓖麻油EL-35、吐溫-80 這4 種乳化劑，以及異丙醇、聚乙二醇400、1，2-丙二醇、無水乙醇這4 種助乳化劑各4 g，置于具塞離心管中，加入過量總黃酮，在20 kHz頻率、室溫下超聲1 h 輔助溶解后37 ℃水浴中靜置24 h，3 000 r／min 離心10 min，吸取適量上清液，甲醇稀釋至適宜濃度，按“2.1”項下方法測定吸光度，計算溶解度，結果見表1。由表可知，總黃酮在聚氧乙烯氫化蓖麻油RH-40、吐溫-80、無水乙醇、1，2-丙二醇中的溶解度較大，故選擇前兩者作為乳化劑，后兩者作為助乳化劑進一步篩選自微乳油相。

表1 總黃酮溶解度測定結果Tab.1 Results of solubility determination of total flavonoids

2.3.2 油相與乳化劑配伍 將辛酸癸酸三甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯這3 種油相與聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、吐溫-80 這2 種乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 比例混合后，加入100 倍量超純水，400 r／min 磁力攪拌，按文獻［13］方法根據乳化時間和液體顏色觀察乳化情況。結果，油酸乙酯與吐溫-80 配伍時乳化時間短，所需乳化劑少，乳化效果好，故選擇前者作為油相，后者作為乳化劑。

2.3.3 助乳化劑 按照油酸乙酯、吐溫-80、助乳化劑2∶4∶4 的比例加入助乳化劑無水乙醇、1，2-丙二醇，400 r／min 磁力攪拌均勻后加入100 倍量超純水磁力攪拌乳化，記錄從加入超純水開始磁力攪拌至完全分散、形成外觀澄清或有藍白色乳光均一微乳所需的時間，即為乳化時間。結果，加入2 種助乳化劑后乳化時間均分別縮短至24、37 s，考慮到無水乙醇易揮發，故選擇1，2-丙二醇作為助乳化劑。

2.3.4 各組分比例范圍［14］先將吐溫-80 與1，2-丙二醇按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 比例混勻，再與油酸乙酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5 比例混勻后，稱取0.5 g 滴加到50 mL 超純水中，400 r／min 磁力攪拌，記錄可形成外觀澄清或有藍白色乳光的均一微乳處方中各組分比例。再以油相、乳化劑、助乳化劑為相圖3 個頂點，Origin8.0 軟件繪制偽三元相圖，結果見圖1，根據微乳區域的邊界確定油酸乙酯、吐溫-80、1，2-丙二醇比例范圍分別為10%～30%、30%～70%、10%～50%。

2.4 處方優化

圖1 自微乳偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram for self-microemulsions

2.4.1 試驗設計［15-17］根據“2.3”項下處方篩選結果，結合單純形網格法比例約束，確定自微乳中各組分比例為油酸乙酯（X1）10%～25%、吐溫-80（X2）45%～60%、1，2-丙 二 醇（X3）30%～45%。再以自微乳平均粒徑（Y1）、多分散指數（Y2）、載藥量（Y3）為評價指標，Design Expert 8.0.6 軟件進行設計，按處方比例精密稱取油相、乳化劑、助乳化劑，400 r／min 磁力攪拌10 min后加入過量總黃酮，混勻，在20 kHz 頻率、室溫下超聲1 h 輔助溶解，靜置24 h，即得自微乳。過濾后，精密稱取0.5 g 置于50 mL 量瓶中，超純水稀釋并定容，搖勻，3 000 r／min 離心10 min，移取適量上清液，測定平均粒徑、多分散指數，按“2.1”項下方法測定吸光度，計算載藥量，公式為載藥量=總黃酮質量／自微乳質量，結果見表2。

表2 試驗設計及結果Tab.2 Design and results of tests

2.4.2 模型擬合及方差分析 通過Design Expert 8.0.6 軟件進行多元回歸模型擬合，得方程分別為Y1=-77.772 60X1-77.945 24X2-19.639 91X3+11.678 00X1X2+5.708 27X2X3+20.655 94X1X3-0.441 59X1X2X3、Y2=-0.005 48X1+0.012 17X2-0.004 11X3、Y3=-0.051 34X1-0.072 01X2+0.197 74X3。再進行方差分析，可知各模型P＜0.000 1，失 擬 項P＞0.05，回 歸 方 程 系 數R2＞0.80，表明模型擬合度良好。

2.4.3 響應面分析 見圖2。

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5 驗證試驗 自微乳粒徑越小，粒徑分布越窄，越有利于藥物的溶出與吸收；載藥量越大，實際服用劑量越少，越便于臨床應用。因此，綜合考慮3個指標，以平均粒徑、多分散指數符合要求并盡可能小，載藥量最大為指標，Design Expert 8.0.6 軟件進行優化，得最優處方為油酸乙酯、吐溫-80、1，2-丙二醇比例10∶45∶45。再根據優化處方制備3 批自微乳，進行驗證試驗，結果見表3、圖3，可知處方穩定可行。

3 討論

圖3 自微乳粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of self-microemulsions

本實驗采用D101 大孔吸附樹脂分離純化金銀花總黃酮時，依次用適量純化水和30%乙醇除雜，再用70%乙醇洗脫，發現純度較高，粒徑較預實驗沒有除雜所得的自微乳減小，載藥量顯著增大，說明理化性質差別較大的雜質會對其形成產生特殊影響。因此，在對中藥有效部位自微乳處方進行研究時，應盡可能采用多種純化方法提高其純度。

本實驗首先根據金銀花總黃酮在幾種備選乳化劑、助乳化劑中的溶解度初步篩選，然后通過油相、乳化劑的配伍實驗來確定種類，接著篩選助乳化劑，根據偽三元相圖確定各自比例范圍，最后用單純形網格法進一步優化。這與測定總黃酮在各種備選油相、乳化劑、助乳化劑中的溶解度來篩選處方不同，主要是因為即使總黃酮在某種油相中的溶解度最大，與乳化劑、助乳化劑配伍后未必是最優處方，甚至有時候并不能形成穩定的微乳，還需要進一步選擇溶解度次之的油相去配伍。為了減少油相、乳化劑、助乳化劑配伍次數，避免盲目性篩選，本實驗略去了總黃酮在各種備選油相中的溶解度數據。

由于金銀花總黃酮在無水乙醇中的溶解度大于1，2-丙二醇，故預實驗以其為助乳化劑，偽三元相圖微乳區域各組分的比例分別為10%～40%油酸乙酯、30%～80% 吐溫-80、10%～60% 無水乙醇，但用單純形網格法優選時有個別處方不能形成穩定的微乳，可能是由于攪拌時無水乙醇揮發，從而使各組分比例發生變化，降低了穩定性，故選用對金銀花總黃酮溶解能力較好、不揮發的1，2-丙二醇作為助乳化劑。另外，采用單純形網格法優選處方時，14 組實驗形成的空白微乳均為澄清或略泛藍色，并均能在室溫下穩定存在。

處方篩選優化是自微乳制劑研究最關鍵的部分，目前可應用正交試驗、均勻設計實驗、星點設計-效應面法等進行研究，每種方法都有其優缺點。其中，基于Design Expert 8.0.6 軟件試驗設計、模型構建、結果預測的單純形網格法是采用空間圖形淘汰法進行處方優選，通過因素之間的相互約束來影響指標，在確定處方組成的響應面和最佳范圍方面優勢獨到，尤其適合自微乳這類組分總量恒定的劑型，而且考察因素數目相同時實驗次數少于星點設計-效應面法，不必連續進行多次試驗，預測結果準確。綜上所述，單純形網格法拓寬了自微乳處方篩選方法，可為相關優化研究提供新思路。