Na2SeO3對藥食用真菌蛹蟲草子實體生長及功能成分腺苷、蟲草素的影響

馬麥艷，張相鋒，馬正海，焦子偉

(1.新疆大學生命科學學院，烏魯木齊 830046；2.伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】我國是世界上主要的硒資源國之一，但仍然是缺硒大國，2/3的地區存在不同程度的缺硒[3]。人體通常通過生物轉化的方式來補硒[4,5]。真菌具有較強的生物富集和轉化能力，可以將無機物轉化為有機物。蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)是一種和冬蟲夏草相媲美的藥食兩用真菌，且具有良好的富硒能力[6,7]。鑒于不同地區蛹蟲草生物學特性會有一些差異性，因此，對新疆蛹蟲草生物富硒進一步研究，為開發天然富硒蛹蟲草提供技術支持。【前人研究進展】食用菌作為富硒載體，其效果較好，如今在我國正被廣泛應用，目前已培育出富硒靈芝、富硒金針菇、富硒平菇等產品[8-11]。在生物載體方面，而關于富硒蛹蟲草的研究相對較少，于田田等[12]研究生物富硒對人工蛹蟲草菌絲體中粗脂肪、粗蛋白、總灰分、蟲草素、腺苷、蟲草酸及蟲草多糖等多種功效成分含量均有顯著影響。凌宏通等[13]研究表明,硒可提高蛹蟲草的耐硒能力，但加過量硒源會導致蛹蟲草分化時間延長和子座產量降低。【本研究切入點】不同地區蛹蟲草生物學特性會有一些差異。以亞硒酸鈉(Na2SeO3)作為外源硒，新疆地區蛹蟲草為富硒載體，采用不同硒濃度培養液對蛹蟲草進行人工栽培處理，研究蛹蟲草對亞硒酸鈉的耐受性。【擬解決的關鍵問題】系統研究不同濃度亞硒酸鈉處理對蛹蟲草菌絲、子座、子實體生長，產量、總硒及其功能成分腺苷、蛹蟲草含量的影響，研究富硒蛹蟲草栽培最佳適宜的濃度，為大面積人工栽培富硒蛹蟲草提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為不同交配型MAT1-1和MAT1-2代表菌株d9、a11，來源于實驗室。

1.1.2 供試培養基

改良PDA固體培養基、改良PD液體培養基[14]。

含硒培養液：在配好的改良PD液體培養基中分別加入一定量的Na2SeO3，分別配成硒濃度為20、40、60、80、100、150和200 mg/L含硒培養液。

大米培養基：每個組培瓶中加入20 g大米和20 mL不同濃度含硒改良培養液，蓋緊瓶蓋，于115℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

試驗共設計8個處理，每個處理重復3次。表1

表1 不同處理人工栽培培養基
Table 1 Artificial media ingredents of different treatments

處理Treatments人工培養基配方Artificial cultivation medium ingredients 1大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(20 mg/L)濃度的含硒培養液2大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(40 mg/L)濃度的含硒培養液3大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(60 mg/L)濃度的含硒培養液4大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(80 mg/L)濃度的含硒培養液5大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(100 mg/L)濃度的含硒培養液6大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(150 mg/L)濃度的含硒培養液 7大米 20 g/瓶+20mL/瓶(200 mg/L)濃度的含硒培養液8(CK)大米 20 g/瓶+20 mL/瓶不含硒的改良培養液

1.2.2 蛹蟲草栽培

人工栽培參照努爾買買提等[14]的方法進行。

將MAT1-1，MAT1-2兩個菌株接種于改良PDA培養基培養15～20 d進行活化。將活化后的兩種菌種分別接種在改良PD液體培養基中，獲得d9、a11兩種菌懸液。將這兩種菌懸液等體積混合均勻后用無菌水稀釋10倍，吸取10 mL均勻添加到各個處理的培養瓶中，放置培養室進行培養，培養期間人工定期對培養室進行消毒擦洗，在室內相對濕度(80%)、溫度(25 ± 1)℃和光照16 h條件下培養55～60 d。

1.2.3 蛹蟲草子實體生物量的測定

定期對不同濃度亞硒酸鈉處理的蛹蟲草子菌絲體及子實體生長狀況進行觀察、記錄；將在不同培養基上培養55～60 d的蛹蟲草子實體進行采收。并對采收的蛹蟲草子實體的長度、干重、鮮重、生物轉化率、硒含量及主要功能成分等相關指標進行測定。

1.2.4 蛹蟲草子實體中硒含量檢測

蛹蟲草子實體中硒含量檢測方法參照蔡寶祥等方法[15]。

1.2.5 蛹蟲草子實體中腺苷、蟲草素含量檢測

采用高效液相色譜法進行檢測[16]。

測定條件∶C18∶250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相∶A∶乙腈B∶1.0%乙酸，A∶B(v/v)=5∶95；流速：1.0 mL/min，柱溫：35℃，檢測波長：260 nm，進樣量：10 μL。

標準溶液配制：取蟲草素、腺苷標準品各10 mg(按實際含量折算)，用流動相(乙腈∶水(v/v)為5∶95)定容至100 mL(100 μg/mL)，充分搖勻。

標準曲線繪制：配制不同梯度的蟲草素和腺苷標準品溶液，分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL標準溶液定容至10 mL，標準曲線濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL。將待測提取液逐一進高效液相色譜儀進行檢測，根據標準曲線計算其蟲草素和腺苷的含量。

1.3 數據處理

采用SPSS軟件(Version 11.5，USA)、EXCEL軟件對數據進行方差分析(ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長

研究表明，經接菌、人工栽培后，不同濃度Na2SeO3處理與對照相比，處理1和處理2中的蛹蟲草菌絲體生長狀況最好，接種后4 d，菌絲已布滿整個培養基基質，且菌絲密度最好，菌絲轉成橘黃色速度最快，10～11 d菌餅變黃；其它處理的蛹蟲草菌絲生長情況不盡一致。處理3、處理4與對照處理相比，對蛹蟲草菌絲體生長有輕微的抑制作用，菌餅變黃用時14 d，菌絲密度較好，菌絲轉色較快；而處理5(硒濃度100 mg/L)對蛹蟲草菌絲體生長具有明顯的抑制作用，菌絲轉色速度較慢，且菌餅變黃用時19 d；處理7(硒濃度200 mg/L)蛹蟲草菌絲生長情況最差，抑制最強，菌絲長滿培養基用時19 d，菌餅變黃用時33 d，且菌絲密度最差，菌絲轉成橘黃色速度最慢。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草菌絲體生長無影響，但隨著硒濃度的不斷增加，對其菌絲體生長抑制越強。表2

表2 不同處理蛹蟲草的菌絲生長比較
Table 2 Comparison on growth of hypha inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments菌絲長滿時間Mycelia overgrown time (d)菌絲密度Mycelia density菌絲轉色Mycelia color transformation菌餅變黃時間Media colour transformation (d)14++++白色變橘黃色快1024++++白色變橘黃色快113 6+++白色變橘黃色較快1446+++白色變橘黃色較快1459+++白色變橘黃色較慢19611++白色變橘黃色慢24719+白色變橘黃色最慢338(CK)4++++白色變橘黃色快11

注：“++++”密度最好；“+++” 密度較好；“++” 密度一般； “+”密度差

Note: “++++” indicates the best density; “+++”indicates better density; “++” indicates ordinary density; “+”indicates poor density

2.2 蛹蟲草子實體生長

研究表明,不同處理的蛹蟲草子實體生長狀況及各項生物學指標各不相同。與對照相比，處理1、處理2表現最好，蛹蟲草子實體形成時間最早，為27 d，子座粗長、均勻，子實體正常、橘紅色，有子囊殼，且出草質量最好；處理3、處理4對蛹蟲草子實體生長僅有輕微的抑制作用，這兩個試驗組的蛹蟲草各項生物學指標均表現較好，出草時間較早，用時29 d，子座較粗長、均勻，子實體較正常、橘紅色，有子囊殼，出草質量較好；處理5(硒濃度100 mg/L)時，對蛹蟲草子實體生長具有明顯的抑制作用，出草時間為33 d，子座粗短，出草較晚，且出草質量較差；Na2SeO3濃度為150 mg/L的試驗組次之；處理7(硒濃度200 mg/L)蛹蟲草子實體生長及各項生物學指標表現最差，僅少量出草，且細短，出草最慢，有子囊殼，出草質量最差。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子座、子實體生長無影響但隨著硒濃度的不斷增加，對蛹蟲草子座、子實體生長抑制越強。表3

表3 不同處理蛹蟲草的子實體生長比較
Table 3 Comparison on growth of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments出草時間Formation time of fruiting-body子座生長Stromata formation子實體生長及色澤Fruiting-body growth and colour子囊殼Ascocarp出草質量Fruiting-body Quality127子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++227子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++3 29子座較粗長,均勻出草較早,較正常,橘紅色有++429子座較粗長,均勻出草較早,較正常,橘紅色有++533子座粗短,均勻出草較晚,較差,橘紅色有+635子座粗短,均勻出草較晚,較差,橘紅色有+742子座較細短,不均勻出草最晚,最差,僅部分出草,橘紅色有-8(CK)27子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++

注：“+++”表示80%的子實體直徑≥3 mm，長度≥4 cm；“++”表示80%的子實體直徑≥2 mm，長度≥3 cm；“+”表示80%的子實體直徑≥1 mm，長度≥2 cm。“-”表示80%的子實體直徑<1 mm，長度<2 cm

Note: “+++” means 80% of the fruitbody dimeter ≥3 mm, and length ≥4 cm; “+ +” means means 80% of the fruitbody dimeter ≥2 mm, and length ≥3 cm; “+” means 80% of the fruitbody dimeter ≥1 mm, and length ≥2 cm; “-” means 80% of the fruitbody dimeter <1 mm, and length <2 cm

2.3 蛹蟲草出草比較

研究表明,不同處理對蛹蟲草子實體生長狀況有不同的影響。處理1、處理2與對照相比對蛹蟲草子實體無影響，長勢最好，子實體粗長、均勻，色澤鮮艷；處理3、處理4對蛹蟲草子實體生長具有輕微的抑制作用，蛹蟲草長勢較好；處理5和處理6對其抑制作用較明顯，蛹蟲草子實體長勢較差；處理7(硒濃度200 mg/L)對蛹蟲草子實體生長影響最大，長勢最差，僅少量出草，且細短，不均勻。圖1

處理1和處理2兩個處理與對照相比對蛹蟲草子實體的長度、鮮重、干重、生物轉化率等方面無顯著差異(P<0.05，下同)；處理2的蛹蟲草子實體鮮重最高，為8.94 g，生物轉化率44.68%。處理3至處理7與對照相比對蛹蟲草的鮮重、干重、生物轉化率等方面均呈顯著性差異；處理3當硒濃度達到60 mg/L，蛹蟲草的除鮮干比以外其他指標明顯低于對照，并呈顯著性差異；處理7(硒濃度200 mg/L)的蛹蟲草除鮮干比以外其他指標均表現最差，其處理的子實體長度3.48 cm，鮮重5.12 g，干重1.13 g，生物轉化率最低，為25.30%。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子實體的鮮重、干重、生物轉化率生長無影響，但隨著處理硒濃度不斷增加，對蛹蟲草子實體的長度、鮮重、干重、生物轉化率等降低越明顯。表4

圖1 不同處理人工栽培蛹蟲草子實體效果
Fig. 1 Effects on fruitbody ofCororcepsrnitarisin artificial cultivation served as different treatments

表4 不同處理的蛹蟲草子實體相關指標
Table 4 Relative index analysis of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments子實體長度 Fruitbody length (cm)鮮重 (g/瓶)Fresh weight (g/bottle)干重(g/瓶)Dry weight (g/bottle)鮮干比Fresh dry ratio生物轉化率Biological conversion rate (%)15.88±0.09a8.82±0.24a1.74±0.04a5.24±0.10abc43.76±1.21a25.79±0.18a8.94±0.44a1.72±0.04a5.51±0.19a44.68±2.21a3 4.64±0.15c7.59±0.33b1.53±0.04b5.12±0.15abc37.74±1.60b44.65±0.10c7.42±0.26b1.47±0.03bc5.38±0.09ab37.12±1.28b54.05±0.11d7.10±0.16b1.51±0.04bc4.99±0.08bc35.17±0.82b64.14±0.09d6.73±0.18b1.40±0.01c5.09±0.15abc33.32±0.90b73.48±0.08e5.12±0.46c1.13±0.06d4.86±0.15c25.30±2.30c8(CK)6.12±0.14a8.70±0.18a1.80±0.03a5.10±0.11abc43.36±0.90a

注:數據為平均值和標準誤差。(a-e)，不同字母表示為顯著性差異(P< 0.05)，下同

Note: Data is the mean and standard error (a-e), and the different letters indicate significant differences (P< 0.05), the same as below

2.4 總硒含量檢測

研究表明,處理1至處理7與對照相比，其處理的蛹蟲草子實體中總硒含量均呈顯著性差異(P<0.05，下同)。處理1和處理2相比，其子實體總硒含量無顯著性差異，處理2的總硒含量最高，達31.2%；處理1、處理2與處理3、處理4、處理5、處理6、處理7之間相比，其總硒含量呈顯著性差異。處理3和處理4的蛹蟲草子實體中總硒含量差異不顯著；但隨著培養基中硒濃度的增加，蛹蟲草子實體中總硒含量下降，處理7(硒濃度200 mg/L)的蛹蟲草子實體中總硒含量最低，為4.01%。結果表明，處理1、處理2的蛹蟲草子實體總硒含量最高，但隨著硒濃度處理的不斷增高，其子實體中總硒含量不斷降低。表5

表5 不同處理子實體中總硒含量
Table 5 Total selenium content of fruiting body served as different treatments

處理 Treatments總硒含量Selenium content(%)130.70±0.28a231.20±0.32a326.74±0.47b422.68±0.19c522.45±0.47c618. 38±0.16d74.01±0.437e

2.5 功能成分腺苷、蟲草素含量

研究表明，處理1、處理2與對照相比呈顯著性差異(P<0.05，下同)，功能成分含量增加；處理1和處理2之間呈顯著性差異，其中處理1的功能成分腺苷為1 409 μg/g，蟲草素12 017.54 μg/g，最高。處理3至處理7與對照相比也呈顯著性差異，隨處理濃度不斷增加其功能成分含量逐漸降低，以處理7的最低，為腺苷含量為593.64 μg/g，蟲草素含量為4 235.89 μg/g。結果表明，硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子實體的功能成分腺苷、蟲草素的含量呈增加現象；但硒濃度≥60 mg/L時，隨著硒濃度的增加其功能成分腺苷、蟲草素的含量呈下降趨勢。表6

表6 不同處理子實體中腺苷、蟲草素含量
Table 6 contents of adenosine and cordycepin of fruiting body served as different treatments

處理Treatments腺苷Adenosine(μg/g)蟲草素Cordycepin(μg/g)11 409.05±5.08a12 017.54±8.30a21 315.15±11.67b11 211.33±9.77b31 112.66±10.77c9 521.12±2.70d41 012.33±7.56d9 107.10±3.28e5924.40±4.93e6 808.12±4.66f6713.37±6.98f5 856.09±4.67g7593.64±6.45g4 235.89±5.33h對照組(CK)1 105.33±9.96c9 831.11±4.23c

3 討 論

以新疆本地蛹蟲草作為富硒載體，研究表明,各個不同濃度Na2SeO3處理對蛹蟲草菌絲密度、菌絲長滿時間、菌絲轉色情況、菌餅變黃時間、子座生長、子實體的出草時間、子實體生長以及出草質量等各項生物學指標的影響各不相同。處理1(硒濃度20 mg/L)和處理2(硒濃度40 mg/L)與對照相比其蛹蟲草的菌絲體生長、子座生長、子實體出草長度、鮮重、干重、生物轉化率等方面無影響；從處理3(硒濃度60 mg/L)至處理7(硒濃度200 mg/L)與對照相比，其蛹蟲草的菌絲體生長、子座生長受到抑制，其子實體出草長度、鮮重、干重、生物轉化率等呈顯著性差異(P<0.05)，呈降低趨勢，并隨著的硒濃度增加，抑制作用越明顯，以處理7的最為嚴重，其處理的蛹蟲草各項指標表現最差，即子實體長度3.44 cm，鮮重5.04 g，干重1.05 g，鮮干比為4.79，生物轉化率最低，為25.22%。陳宏偉等[17]研究表明,較低硒濃度促進蛹蟲草菌絲體生長，較高濃度硒抑制其菌絲生長；杜雙田等[18]研究也表明,在蛹蟲草菌株CM-003平板培養基上亞硒酸鈉質量濃度≤100 mg/L時對蛹蟲草的菌落形態基本正常，菌落直徑變化較小；當亞硒酸鈉質量濃度為450 mg/L時，其菌絲緩慢生長；隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，采用常規瓶栽法的蛹蟲草的長勢評分和子座產量呈先增加后減小現象。盡管和研究有一定的相似之處，但不同蛹蟲草菌種資源及栽培條件等也影響其對亞硒酸鈉耐受程度。此外，系統深入地研究了亞硒酸鈉對其菌絲生長、子座生長、子實體生長、出草質量等定性指標，以及對其子實體長度、鮮重、干重和生物轉化率等定量指標進行分析，明確了新疆本地蛹蟲草菌種吸收亞硒酸鈉較為理想的濃度。

杜雙田等[18]研究表明,隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，子座硒含量呈逐漸增加趨勢；亞硒酸鈉質量濃度為200 mg/L時，子座硒含量92.68 mg/kg，最高。這與研究結果有差異，處理1、處理2的蛹蟲草子實體總硒含量最高，但隨著處理硒濃度不斷增高，其子實體中總硒含量不斷降低。處理1、處理2與對照相比其蛹蟲草子實體的腺苷、蟲草素含量明顯增加。這與于田田等[12]研究結果相似，即生物富硒對蛹蟲草菌絲體化學成分(營養和功效成分)含量有一定影響，富硒蛹蟲草的腺苷、蟲草素含量等明顯高于普通蛹蟲草。當亞硒酸鈉濃度逐步增加時，子實體中的腺苷、蟲草素含量逐漸下降，這可能是硒的存在對蛹蟲草子實體代謝產生一定的影響，其影響機理有待進一步深入系統研究。

4 結 論

低濃度Na2SeO3對新疆地區蛹蟲草的菌絲密度、菌絲長滿時間、菌絲轉色情況、菌餅變黃時間、子座生長、子實體出草時間、子實體生長、出草質量、子實體出草長度、鮮重、干重、生物轉化率等方面無影響，其總硒含量較高和功能成分腺苷、蟲草素含量增加；高濃度Na2SeO3抑制其生長、總硒含量較低和功能成分腺苷和蟲草素含量下降。以亞硒酸鈉作為外源硒，硒濃度20～40 mg/L效果最好，可作為進行蛹蟲草富硒栽培較為理想的濃度。