感官異常番茄醬和杏醬中腐敗細(xì)菌的分離及分子生物學(xué)鑒定

巴哈提古麗·馬那提拜,師 璐,李曉巖,蘇 歡,張雪妮,房 芳,蔣剛強

(新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】果蔬罐頭是蔬菜或水果等新鮮農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)原料挑選、原料加工、罐裝、密封、殺菌而制成的保藏食品[1]。新疆晝夜溫差大，光照時間長、屬于典型的溫帶大陸性氣候，得天獨厚的地理自然條件和水土資源非常有利于瓜果作物的生長，無論是水果還是蔬菜都有著較高的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，而降雨量少、空氣干燥等氣候條件則大大減少了植物病蟲害發(fā)生[2,3]。由新疆番茄、杏等特色農(nóng)產(chǎn)品加工制成的濃縮番茄醬、杏醬等果蔬罐頭已成為新疆地區(qū)的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，也是新疆出口產(chǎn)品的標(biāo)志。近年來，憑借充足的原料、優(yōu)越的地域優(yōu)勢和較低的生產(chǎn)成本，新疆特色果蔬罐頭產(chǎn)品的出口逐年增長。伴隨著產(chǎn)量的增長，這類產(chǎn)品的酸敗、脹罐及色澤氣味改變等問題也日益突出，而微生物是造成這些問題的主要原因[4]。【前人研究進展】曹紅建等[5]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，從新疆杏醬中分離得到緩慢葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、花域芽孢灰棗桿菌、短小芽孢灰棗桿菌等。吳彩蘭[6]研究表明，在新疆番茄中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌中芽孢灰棗桿菌是分離頻率最高，數(shù)目最多，是加工番茄內(nèi)生細(xì)菌的主要優(yōu)勢種群。【本研究切入點】目前，新疆番茄醬和杏醬中腐敗微生物的研究主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)分離及鑒定，費時費力, 以往的研究都是以脹罐脹袋的番茄醬研究為主，而一些外觀正常，但感官異常的番茄醬和杏醬發(fā)生腐敗不易察覺。研究采用分子生物學(xué)方法對新疆感官異常的番茄醬和杏醬中細(xì)菌進行快速鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過16S rDNA序列分析并結(jié)合菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，對感官異常的番茄醬和杏醬中腐敗細(xì)菌進行鑒定，為新疆特產(chǎn)番茄醬和杏醬的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)及其中腐敗細(xì)菌防控和提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

分別選取新疆本地生產(chǎn)并加工的具有感官異常現(xiàn)象的濃縮番茄醬和杏醬罐頭。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑及引物

微生物實驗所需的增菌培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基、細(xì)菌(芽孢灰棗)染色液均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。日本MGC厭氧產(chǎn)氣袋購自青島綠谷商貿(mào)有限公司，OMEGA總DNA提取試劑盒購自賽默飛生物科技有限公司。PCR所用PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)購自天翼灃生物科技有限公司。所用的培養(yǎng)基和試劑都在有效期內(nèi)按要求配制、滅菌使用。所用的16S引物序列(5’-3’)為F-AACTGGAGGAAGGTGGGGA和R-AGGAGGTGATCCAACCGCA，引物的合成及測序工作由天翼灃生物科技有限公司完成。

1.1.3 儀器設(shè)備

細(xì)菌的增菌、分離和鑒定工作在百級無菌實驗室或NU-425-400E 生物安全柜里進行。試驗所用的其他儀器設(shè)備包括：pH計、電子天平、厭氧工作站、細(xì)菌培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、水浴鍋、高壓滅菌器、拍擊式均質(zhì)器、離心機、通用凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀，Vitek 2全自動微生物鑒定儀等儀器設(shè)備都通過技術(shù)性驗收或計量確認(rèn)，均運轉(zhuǎn)正常。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基

參照吳海文等[7](2006)、黃忠梅等[8](2007)和曹紅建等[5](2013)對培養(yǎng)基篩選結(jié)果，分別選取腦心浸出肉湯和營養(yǎng)肉湯及腦心浸出瓊脂和營養(yǎng)瓊脂進行增菌和分離培養(yǎng)。

1.2.2 感官評定和pH值的測定

取出適量的罐頭樣品在白色托盤里進行感官檢測(與同一批正常的樣品進行比較)。準(zhǔn)確稱取果蔬罐頭5 g至等量的無菌水稀釋，隨后用pH儀進行反應(yīng)溶液的pH測定。

1.2.3 培養(yǎng)條件和時間

準(zhǔn)確稱取25 g異常樣品至盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，拍打1～2 min，制成1∶10 的樣品勻液，將此勻液進行10倍比稀釋，稀釋至10-7備用。取各稀釋度勻液1 mL置于腦心浸出肉湯和營養(yǎng)肉湯中，將培養(yǎng)物放置36℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每24 h取上述培養(yǎng)物一環(huán)，接種至腦心浸出瓊脂和營養(yǎng)瓊脂后放置36℃條件下恒溫培養(yǎng)，共培養(yǎng)96 h(其中需厭氧培養(yǎng)的樣品在厭氧工作站中稱取后裝至厭氧罐使用厭氧產(chǎn)氣袋進行增菌和分離培養(yǎng))。

1.2.4 DNA提取

待分離培養(yǎng)基上有明顯菌落生長，挑取單菌落于腦心浸出肉湯中，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后進行菌株總DNA的提取。具體提取方法參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書進行。

1.2.5 PCR擴增反應(yīng)

研究的PCR反應(yīng)體系如下表所示。表1

表1 PCR反應(yīng)體系
Table1 Reaction system of PCR

成分Component體積VolumePremix TaqTM10 μL引物1(10 μmol/L)1 μL引物2(10 μmol/L)1 μL模板DNA1 μL加無菌水至總體系20 μL

研究的PCR反應(yīng)程序如下圖所示。圖1

1.2.6 菌株測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

測序和發(fā)育樹的構(gòu)建：將分離所得菌株利用16S rDNA 引物進行PCR擴增，擴增得到的PCR產(chǎn)物進行16S rDNA的測序與分析，測序工作由英濰捷基生物有限公司完成。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLAST比對，并對菌株進行同源性分析，根據(jù)相似性最高的序列推測待鑒定菌株可能的分類地位。經(jīng)分析軟件Clustal X 1.815比對后，通過MEGA 5.1采用鄰近法繪制相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[9,10]。

1.2.7 菌株的生化鑒定

菌株的生化鑒定使用Vitek 2全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

注：“退火溫度根據(jù)引物的Tm值變動，延伸時間根據(jù)擴增目的的片段大小調(diào)整

圖1 PCR反應(yīng)程序
Fig.1 Reaction procedure of PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定和pH值測定

研究表明，異常的濃縮番茄醬和杏醬味道、色澤、組織結(jié)構(gòu)等感官指標(biāo)均有不同程度的變化。番茄醬和杏醬的pH值均低于4.6，屬于酸性罐藏食品，異常的番茄醬和杏醬的pH值均有降低的趨勢。表2

表2 感官評定結(jié)果和pH值
Table 2 Sensory evaluation results and pH value measurement results

項目Items狀態(tài)Status番茄醬Canned tomato杏醬Apricot jam香味正常輕微的香味明顯的香味異常輕微或明顯的酸味明顯的刺激酸味色澤正常鮮紅色,純正柔和鮮黃色異常黑紅、淡紅或橘黃色不柔和深黃色滋味正常風(fēng)味好,酸度適中微酸、口感佳異常較酸、口感較差(苦)口感極差、苦酸組織正常均勻、粘稠適中均勻、細(xì)膩異常不均勻、粗糙不均勻、粗糙pH值正常4.263.67異常4.143.48

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株分離篩選及生化鑒定

感官異常番茄醬和杏醬中的菌株分離篩選按照1.2的方法進行。分離得到9株菌株經(jīng)Vitek 2全自動微生物鑒定儀鑒定為甲基營養(yǎng)性芽孢灰棗桿菌、枯草芽孢灰棗桿菌、地衣芽孢灰棗桿菌、沃氏葡萄球菌、糞鏈球菌、巴氏葡萄球菌、糞腸球菌、類芽孢灰棗桿菌。表3

表3 濃縮番茄醬和杏醬中鑒定的細(xì)菌類型
Table 3 Identified bacterial types in concentrated tomato and apricot sauce

樣品名稱Sample name菌株類型Strain type番茄醬Canned tomato甲基營養(yǎng)性芽孢灰棗桿菌(Bacillus methylotrophicus)枯草芽孢灰棗桿菌(Bacillus subs)地衣芽孢灰棗桿菌(Bacillus licheniformis)沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)糞鏈球菌(Enterococcus faecium)杏醬Apricot jam巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)糞腸球菌(Enterococcus faecium)沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)類芽孢灰棗桿菌 (Paenibacillus cookii sp.)

2.2.2 菌株總DNA提取

分離培養(yǎng)基上有明顯菌落生長后挑取單菌落于BHI肉湯中，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h(厭氧或微需氧條件下分離的菌株采用厭氧或微需氧產(chǎn)氣袋在厭氧罐中培養(yǎng))后進行菌株總DNA的提取，其中分離提取得到9株菌株，將所得菌株序列提交至NCBI進行BLAST比對后進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。圖2

注：M: DL5 000 Marker (5 000 bp, 3 000 bp, 2 000 bp, 1 500 bp, 1 000 bp, 750 bp)泳道1至9：S-1至S-9的PCR擴增；泳道10 陽性對照；泳道11 空白對照；

Note:Lane1 to Lane 9: PCR product of S-1 to S-9 (1,500 bp); Lane 10: Positive control；Lane11: Blank control;

圖2 細(xì)菌總DNA提取PCR電泳圖
Fig. 2 PCR electrophoresis extracted from total bacterial DNA

2.2.3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建按照1.2.6的方法進行，鑒定的菌株分別有甲基營養(yǎng)性芽孢灰棗桿菌(Bacillusmethylotrophicus)、枯草芽孢灰棗桿菌(Bacillussubtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)、地衣芽孢灰棗桿菌(Bacilluslicheniformis)、類芽孢灰棗桿菌(Paenibacilluscookiistrain)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)，構(gòu)建的發(fā)育樹。圖3

3 討 論

一般罐頭食品敗壞的發(fā)生率很低，往往是原料選擇和加工不當(dāng)，滅菌不充分和包裝過程不嚴(yán)實等原因?qū)е庐a(chǎn)品產(chǎn)氣、酸敗、脹罐及色澤氣味的改變[11]，威脅消費者的身體健康及生命安全。研究對新疆特色果蔬罐頭濃縮番茄醬和杏醬進行了感官評定、細(xì)菌的分離及分子生物學(xué)鑒定。按照pH的檢測結(jié)果，濃縮番茄醬和杏醬的pH值均<4.6，屬于酸性罐藏食品，且出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象的感官評定異常罐頭的pH值低于正常罐頭，這可能與罐頭中的腐敗菌有一定的關(guān)系。據(jù)報道罐藏食品中的球菌能分解糖類產(chǎn)酸，導(dǎo)致該類食品的pH降低[7]。

采用細(xì)菌總DNA提取并對PCR產(chǎn)物進行擴增與測序，再對測序結(jié)果進行進化關(guān)系分析最終得到分離的9株細(xì)菌，分別為芽孢灰棗桿菌類(甲基營養(yǎng)性芽孢灰棗桿菌、類芽孢灰棗桿菌、地衣芽孢灰棗桿菌、枯草芽孢灰棗桿菌)和腸球菌類(沃氏葡萄球菌、糞腸球菌、巴氏葡萄球菌)。濃縮番茄醬中鑒定的芽孢灰棗菌為甲基營養(yǎng)性芽孢灰棗桿菌、枯草芽孢灰棗桿菌、地衣芽孢灰棗桿菌，球菌類有沃氏葡萄球菌、糞腸球菌。其中，地衣芽孢灰棗桿菌和沃氏葡萄球菌是兼性厭氧獲得菌。這些結(jié)果與黃忠梅等[8]番茄醬中檢出的20 株菌分別為埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢灰棗桿菌屬、葡萄球菌屬等, 均為兼性厭氧菌基本吻合。芽孢灰棗桿菌具有代謝快、繁殖快和生長能力強等特點，最快4 h增殖10萬倍，并且體積比一般病原菌分子大4倍數(shù)，相比之下占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制病原菌生長[12]。

研究在杏醬中分離鑒定的細(xì)菌以球菌為主包括巴氏葡萄球菌、糞腸球菌、沃氏葡萄球菌。其中巴氏葡萄球菌為厭氧培養(yǎng)獲得。芽孢灰棗桿菌只有一種為類芽孢灰棗桿菌，可能與杏醬較低的酸度有關(guān)系。有研究表明，芽抱桿菌耐酸能力較低，酸度高的罐藏食品中基本無法存活，但酸性罐頭食品中發(fā)現(xiàn)有芽抱桿菌的存在，可能是殺菌不徹底或有漏罐現(xiàn)象[7]。曹紅建等[5]在新疆杏醬中分離得到緩慢葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、花域芽孢灰棗桿菌、短小芽孢桿菌等。糞腸球菌和沃氏葡萄球菌是新疆番茄醬和杏醬中共同存在的球菌。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig. 3 The strain phylogenetic tree

4 結(jié) 論

通過分子生物學(xué)方法對感官異常的濃縮番茄醬和杏醬中的腐敗細(xì)菌進行鑒定，結(jié)果表明，番茄醬中分離獲得的細(xì)菌以芽孢菌為主，杏醬中的細(xì)菌以球菌為主，其中沃氏葡萄球菌和糞腸球菌是這兩類醬產(chǎn)品的共有菌種，在番茄醬和杏醬的加工生產(chǎn)中應(yīng)加強防范此類微生物。分子生物學(xué)方法鑒定感官異常番茄醬和杏醬中的細(xì)菌快速準(zhǔn)確，鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致。