C 反應蛋白基因單核苷酸多態性與膿毒癥易感性及嚴重程度的關系

唐玉霞 單國勇 狄君斐

膿毒癥是一種由感染引起的危及生命的系統性炎癥反應綜合征[1]。炎癥反應的程度與膿毒癥的預后密切相關。C 反應蛋白（CRP）是膿毒癥的重要生物標志物，可反映炎癥反應和敗血癥的嚴重程度[2-3]。CRP基因的遺傳變異在血管損傷中發揮作用，而血管損傷可能是膿毒癥引起的微血管功能障礙的基礎[4-5]。然而，CRP 基因多態性與膿毒癥易感性和嚴重程度的相關性尚不明確。基于此，本研究探討CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點與膿毒癥的易感性和嚴重程度之間的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年8 月期間浙江省臺州市中西醫結合醫院普內科收治的125例膿毒癥患者作為研究組，年齡23～75 歲，其中一般膿毒癥患者72 例，急性生理與慢性健康評估II（APACH II）（16.54±4.47）分；嚴重膿毒癥患者53例，APACH II（22.35±5.12）分。根據研究組患者的年齡、性別等匹配招募同期健康體檢者125 名作為對照組。本研究經醫院倫理委員會審核通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合2001 年美國危重病醫學會/美國胸科醫師學會制定的膿毒癥的診斷標準[6]；（2）年齡≥18 歲；（3）臨床病歷資料完整。排除標準：（1）年齡＜18 歲；（2）孕婦或處于哺乳期的婦女；（3）嚴重的臟器功能異常；（4）患免疫系統疾病；（5）腫瘤患者。

1.3 基因分型 所有受試者均抽取4mL 靜脈血，其中2mL 采用EDTA 抗凝后使用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組提取試劑盒（DP318，規格：50次）提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱。利用Primer 5.0 軟件根據NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）數據庫中相應SNP 位點序列信息設計引物，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。rs1205位點的引物序列為上游：5′-AGGGGACTCTTGGACAGGTT-3′，下游：5′-TTATGGACTTTGGGAGTGAGAC-3′；rs3093062 位點的序列為上游：5′-CAAACTCTATGATTTGGGCTGAAGT-3′，下游：5′-ACGAGTGGCCATCTGGGTG-3′。PCR 擴增體系為20μL，模板基因組DNA 25ng，10×PCR buffer 2μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，10μmol/L dNTP 1μL，10pmol/L 的上、下游引物各1μL，0.25μL DNA 聚合酶，用無菌水補足至20μL。PCR 反應條件為：95℃，5min；94℃，20s；60℃，30s；72℃，30s，35 個循環；72℃，5min；4℃保存。PCR 完成后將PCR 擴增產物純化，然后將純化產物送上海生工生工生物工程技術公司進行測序，結果見圖1。

1.4 血清CRP 蛋白水平檢測 將剩余的2mL 全血3000r/min 離心20min，取上清，保存于-70℃冰箱。血清CRP 檢測試劑盒采用abcam 酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號ab99995，批號201403021）檢測，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件進行數據統計，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t 檢驗，計數資料以頻數[n（%）]表示，采用χ2檢驗。基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗。采用χ2檢驗分析等位基因和基因型頻率的差異，并估計比值比（OR）和95%置信區間（CI），P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

圖1 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點測序結果

表1 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型和等位基因頻率[例（%）]

2.1 兩組一般資料比較 研究組男81 例，女44 例，平均年齡（56.50±10.85）歲，體質指數（BMI）（23.42±2.73）kg/m2，有吸煙史56 例，有飲酒史75 例。對照組男78 例，女47 例，平均年齡（57.10±11.55）歲，BMI（23.67±2.08）kg/m2，有吸煙史52 例，有飲酒史81 例。研究組和對照組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 CRP 基因單核苷酸多態性（SNP）與膿毒癥易感性 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。CRP基因rs1205 位點基因型頻率在研究組和對照組之間差異有統計學意義（χ2=6.64，P=0.04），該位點TT 基因型是膿毒癥的危險因素（OR=3.02，95%CI=1.18～7.87，P=0.01），研究組rs1205 位點T 等位基因頻率顯著高于對照組（χ2=5.05，P=0.03），該位點T 等位基因是膿毒癥發生的危險因素（OR=1.53，95%CI=1.04-2.25，P=0.03）。研究組和對照組CRP 基因rs3093062位點不同基因型頻率之間的差異有統計學意義（χ2=18.30，P＜0.01），GA 和AA 基因型是膿毒癥的危險因素（OR=2.68，95%CI=1.19～4.83，P＜0.01；OR=4.18，95%CI=1.59～11.29，P＜0.01），研究組rs3093062 位點A 等位基因頻率顯著高于對照組（χ2=19.51，P＜0.01），該位點A 等位基因是膿毒癥的危險因素（OR=2.43，95%CI=1.60～3.70，P＜0.01），見表1。

2.3 CRP 基因多態性與性別、年齡的相關性 本研究中不同性別、年齡受試者CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2-3。

2.4 CRP 基因多態性與膿毒癥嚴重程度相關性不同嚴重程度膿毒癥患者CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型頻率之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），CRP 基因rs1205 位點TT 基因型患者的膿毒癥較為嚴重，CRP 基因rs3093062 位點AA 基因型患者膿毒癥較為嚴重，見表4。

表2 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型與性別的相關性[例（%）]

表3 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型與年齡的相關性[例（%）]

表4 CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點基因型與膿毒癥嚴重程度相關性[例（%）]

2.5 CRP 基因多態性與血清CRP 水平的相關性檢測受試者血清CRP 蛋白水平，結果顯示，研究組患者血清CRP 水平顯著高于對照組，差異有統計學意義 [（75.46±23.54）mg/μL 比（5.24±1.17）mg/μL，t=33.31，P ＜0.01]。比 較CRP 基 因rs1205 位 點 和rs3093062 位點不同基因型受試者血清CRP 水平結果顯示，CRP 基因rs1205 位點CC 基因型受試者血清CRP 水平最低，其次是CT 基因型，TT 基因型受試者最高[（24.53±9.17）mg/μL、（35.75±12.15）mg/μL、（71.24 ±18.45）mg/μL，F=65.34，P ＜0.01]。CRP 基 因rs3093062 位點GG 基因型受試者血清CRP 水平最低，其次是GA 基因型、AA 基因型最高 [（31.45±15.42）mg/μL、（47.98±13.54）mg/μL、（66.97±17.42）mg/μL，F=59.64，P＜0.01]。

3 討論

CRP 是由肝細胞產生的急性期蛋白，CRP 蛋白水平與炎癥反應、癌癥、心臟病和糖尿病有關[7-9]。CRP 基因rs1205 位點SNP 位于CRP 基因的3’UTR區域，與許多疾病有關，包括牛皮癬、結腸直腸癌和糖尿病等[10-12]。rs3093062 位點SNP 位于CRP 基因的啟動子區域，有研究顯示，rs3093062 位點基因多態性與血漿CRP 水平有顯著相關性[13]。

本研究結果顯示，CRP 基因rs1205 位點稀有突變型等位基因是膿毒癥的高危因素，且與疾病嚴重程度相關，分析不同性別、年齡受試者中rs1205 位點SNP 與膿毒癥風險相關性，結果顯示，不同性別、年齡受試者rs1205 位點SNP 與膿毒癥風險不相關，表明性別、年齡對rs1205 位點SNP 無明顯影響。進一步分析結果顯示，rs1205 位點突變型患者血清CRP水平比野生型高。筆者分析原因認為，rs1205 位點位于CRP 基因的3’UTR 區域，該區域可能處于微小RNA（microRNAs）的靶點區域，突變可能影響microRNAs 對CRP 的表達調控作用，但還需要進一步研究證實。

本研究結果還顯示，CRP 基因rs3093062 位點GA 和AA 基因型是膿毒癥的危險因素，攜帶A 等位基因群體是膿毒癥發生的高危群體。另外，不同性別、年齡受試者中rs3093062 位點SNP 與膿毒癥風險也不相關，該位點SNP 也不受年齡和性別的干擾。進一步分析結果顯示，CRP 基因rs3093062 位點突變型受試者血清CRP 蛋白水平較高，說明CRP 基因rs3093062 位點突變影響血清CRP 表達水平。分析原因，筆者認為rs3093062 位點位于CRP 基因的啟動子區域，突變可能影響CRP 蛋白的表達調控，有研究顯示，rs3093062 位點基因多態性與血漿CRP 水平有顯著相關性[14]。此外，Ghaffari 等[15]研究rs3093062位點與冠心病發生風險相關性發現，rs3093062 位點GA 和AA 基因型受試者血清CRP 水平顯著高于GG 基因型，與本研究結果一致。

然而本研究也有不足之處。首先，由于本研究樣本量較小，為了驗證本研究結論的準確性，可能需要進一步擴大樣本量進行進一步研究。其次，CRP 基因rs1205 位點和rs3093062 位點位點均位于CRP 基因的非編碼區，其突變與CRP 表達水平的相關性的具體機制需要進一步研究證實。

綜上所述，CRP 基因rs1205 位點+1846C＞T 突變和rs3093062 位點-409G＞A 突變與膿毒癥易感性及其嚴重程度相關。其機制可能與突變影響CRP 蛋白表達有關，還需要進一步擴大樣本量進行研究。