結腸癌組織Nrf2 和Keap1 表達及其與增殖指數的關系

方帥帥 王 俊

結腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是臨床常見疾病。腫瘤細胞常表現為高度的增殖活性[1]。增殖細胞核抗原（PCNA）是細胞增殖的重要標志蛋白，對失控性增殖及增殖活躍的細胞標記效果理想[2]。核因子E2 相關因子2（Nrf2）及其接頭蛋白Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）與上皮細胞的惡變有關，對機體環境中的氧化過程及腫瘤細胞的增殖有一定的調節作用[3]。近年研究認為Nrf2/Keap1 是腫瘤發生和進展的通路之一[4]。本研究檢測CRC 組織Nrf2 和Keap1 表達，分析其與PCNA 增殖指數的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012 年1 月1 日—2013 年6月10 日期間杭州市第三人民醫院確診為結腸癌的患者96 例作為研究對象，其中男52 例，女44 例，年齡32～89 歲，平均（60.80±6.30）歲。選擇術后腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣＞3cm 的正常結腸黏膜組織作為對照組。標本于術后立即取材，分別留取新鮮組織（-80℃冰箱凍存）和石蠟包埋組織。本研究經醫院倫理委員會審核通過，家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）確診后行根治性手術并由病理醫師確診，依據WHO《消化系統腫瘤病理學和遺傳學》診斷標準及分型[5]；（2）具有完整的臨床及隨訪資料。排除標準：（1）雙原發或多原發癌、林奇綜合癥的患者；（2）有消化道手術史；（3）術前有放、化療史。

1.3 方 法

1.3.1 免疫組化法 應用免疫組化二步法檢測兩組標本組織Nrf2 和Keap1 表達，檢測觀察組標本組織PCNA 表達。實驗基于石蠟包埋組織后切取的4μm切片。三種試劑均購自武漢博士德生物公司，為濃縮液，以50 為不同梯度按不同稀釋比例進行預實驗，選擇顯色最佳的濃度用于正式實驗（Nrf2 和Keap1均為1:300，PCNA 為1:100）。正式實驗由病理科技師操作，DAB 顯色，手工染色及顯色，嚴格按說明書進行，做好質控工作。判讀由病理醫師進行閱片，應用盲法，Nrf2 和Keap1 的顯色部位均是細胞質和/或細胞膜，PCNA 的顯色部位是細胞核，以淡黃色——棕黃色為陽性。在顯微鏡下找熱點區，共選擇5 個400倍視野，以二維進行評分。著色強度：分別以無、弱、中、強計為0、1、2、3 分。陽性判定：分別以＜5%、6%～10%、11%～30%、31%～50%、＞50%為0、1、2、3、4 分。二者之和為總分（0～7 分），以≤3 分為陰性，以＞3 分為陽性。計算陽性率。

1.3.2 Western Blot 法 應用術后留取的新鮮凍存組織，檢測兩組標本組織Nrf2 和Keap1 蛋白半定量表達。具體方法：GAPDH 為內參。取樣本加裂解液后，離心，取上清液提取蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度；放入100℃水浴鍋內煮5min，配制10%SDA-PAG凝膠，加適量蛋白和Loading Buffer 混合液，電泳，之后將Nrf2、Keap1 蛋白和GAPDH 的膠段切下轉移到PVDF 膜上，封閉60min，加入20mL 抗體（Nrf2 和Keap1 均為1:1200）和20mL 一抗稀釋液，4℃過夜，次日洗膜，加入二抗，室溫1h 后洗膜，用ECL 發光液進行顯影。應用Image J V1.47H 軟件進行灰度分析，以蛋白與GAPDH 的比值進行分析。

1.3.3 熒光實時定量PCR 法 應用術后留取的新鮮凍存組織，檢測兩組新鮮組織Nrf2 和Keap1 mRNA表達。擴增程序：95℃5min、95℃20s、67℃25s、95℃22s、60℃35s 時采集熒光。記錄Ct 值，通過2-ΔΔCt法計算目的基因和相對表達水平。ΔΔCt=[Ct 目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）]-[Ct 目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）]。嚴格按實驗步驟完成具體操作，并由專業人士指導，做好質控工作。引物由蘇州睿贏藥物技術有限公司合成。引物序列：GAPDH：上游5＇-GCACAGAGACACGCTACGCTTTA-3＇，下游5＇-TGGCATGAGAAAGGCATAATGCA-3＇；Nrf2：上游5＇-TTCCGGGGACTGACTCCGCTAAG-3＇，下游5＇-GCACACTGAGTTACACTGAGTTC-3＇；Keap1：上游5＇-ATGAACGCCCACTGAGTCGTAG-3＇，下游5＇-GCACGCTGATACACTTTCCCC-3＇。

表1 兩組標本組織Nrf2 和Keap1 蛋白陽性率比較[例（%）]

表2 觀察組不同臨床病理特征Nrf2 和Keap1 陽性率分組[例（%）]

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0 進行統計分析，采用卡方檢驗、t 檢驗、Pearson 相關性檢驗和KM 生存分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組標本組織Nrf2 和Keap1 陽性率比較 觀察組標本組織Nrf2 高表達，Keap1 低表達，兩組標本組織Nrf2 和Keap1 陽性率比較，差異有統計學意義（P 均＜0.01）。見表1、插頁圖1-4。

圖1 正常結腸黏膜組織Nrf2 陰性表達（免疫組化二步法×200）

圖2 正常結腸黏膜組織Keap1 陽性表達（免疫組化二步法×200）

圖3 結腸癌組織Nrf2 陽性表達（免疫組化二步法×200）

圖4 結腸癌組織Keap1 陰性表達（免疫組化二步法×200）

2.2 觀察組不同特征分組標本組織Nrf2 和Keap1陽性率比較 觀察組標本組織Nrf2 和Keap1 陽性率在不同腫物最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移、浸潤深度和TNM 分期亞組的表達差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），Nrf2 和Keap 在不同性別、年齡和分化程度的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 觀察組Nrf2 和Keap1 表達與生存時間的相關性 觀察組隨訪時間6～60 個月，平均34.30 個月，經生存分析顯示，觀察組Nrf2 和Keap1 表達與生存時間相關，即Nrf2 高表達，Keap1 低表達患者的生存時間短。見插頁圖5-6。

圖5 結腸癌組織Nrf2 表達的生存分析

圖6 結腸癌組織Keap1 表達的生存分析

2.4 觀察組Nrf2 和Keap1 表達與PCNA 增殖指數的相關性 相關分析顯示，Nrf2 表達和PCNA 增殖指數具有正相關性（r=0.52，P=0.011）；Keap1 表達和PCNA 增殖指數具有負相關性（r=-0.51，P=0.035）。

2.5 Wesern Blot 檢測兩組Nrf2 和Keap1 半定量表達 觀察組標本組織Nrf2 蛋白平均半定量表達（1.01±0.13），對照組標本組織Nrf2 蛋白平均半定量表達（0.49±0.11），經統計學分析，差異有統計學意義（t=12.31，P＜0.01）。觀察組標本組織Keap1 蛋白平均半定量表達（0.59±0.15），對照組標本組織Keap1 蛋白平均半定量表達（1.08±0.10），經統計學分析，差異有統計學意義（t=10.59，P＜0.01）。見插頁圖7。

圖7 Wesern Blot 檢測結腸腺癌和正常結腸黏膜Nrf2 和Keap1 半定量表達

2.6 熒光PCR 法檢測兩組Nrf2 和Keap1 mRNA 比較 觀察組標本組織Nrf2 mRNA 平均半定量表達（1.01±0.21），對照組標本組織Nrf2 mRNA 平均半定量表達（0.82±0.19），經統計學分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組標本組織Keap1 mRNA 平均半定量表達（0.83±0.15），對照組標本組織Keap1 mRNA 平均半定量表達（1.20±0.25），經統計學分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。見插頁圖8-9。

圖8 結腸癌和正常結腸黏膜組織Nrf2 mRNA 表達

圖9 結腸癌和正常結腸黏膜組織Keap1 mRNA 表達

3 討論

結腸癌（CRC）與腺上皮的惡性改變有關，遺傳學是病變核心。在致癌因素的作用下引起腺上皮的異型增生，細胞的分布及形態結構出現明顯改變[5]。病變發展過程中伴隨著高度的增殖狀態，其中標記增殖最經典的指標是PCNA，其表達于細胞核，能真實客觀反應結腸癌細胞的增殖程度[6]。研究認為，PCNA 可以作為臨床判斷腫瘤預后的重要指標，同時也是細胞去分化的重要標志蛋白[7]。CRC 病理形態中以浸潤肌層為重要特征，因此其侵襲能力強，轉移潛能高。Nrf2 在正常機體中低表達，對防止異源性因子對DNA 的破壞有重要作用。腫瘤性因素的作用下，Nrf2 高表達，使抑制致癌物活化，加速細胞癌變。Keap1 是多區域阻遏抑制性蛋白，Nrf2 蛋白對Keap1有重要的調控作用，其可能是Nrf2 和Keap1 通路的開關因子。研究顯示，Nrf2 和Keap1 定位于細胞漿中，在泛素酶的介導下，使Nrf2 降解加速[8]。腫瘤細胞處于氧化狀態時，Nrf2 和Keap1 能引起Nrf2 結構發生解離，細胞內Nrf2 蛋白水平升高并轉移到細胞核內，并與抗氧化反應的分子相結合，激活靶基因。Nrf2 和Keap1 能形成強力的聚合體，可以作為Cullin結構中依賴的E3 泛素連接酶復合物的基板，對調節細胞增殖和細胞遷移有一定作用。Keap1 的DGR 區有重復的結構域，能與Nrf2 的DLG 結構區域相結合，對泛素酶進行有效轉移，加速蛋白酶體的降解。此時Nrf2 由于不被降解，引起Keap1 的過度飽和，形成新的Nrf2 聚集區，并有效的調動機體的細胞保護因子。Nrf2 和Keap1 可能是內源性抗氧化和自由基形成的因子，Nrf2 和Keap1 的表達可以調節細胞的炎癥反應及腫瘤性改變[9-10]。在肺癌和乳腺癌中發現Nrf2 和Keap1 的異常表達，其侵襲和轉移能力明顯增強，認識到其不僅與生物學進展相關，其還可能是重要的診斷因子和治療的靶點[11]。

本研究結果顯示，結腸癌組織Nrf2 和Keap1 異常表達，提示Nrf2 高表達和Keap1 低表達是促進腫瘤形成的重要的蛋白因素，Nrf2 和Keap1 蛋白表達和mRNA 表達具有明確的一致性。結腸癌組織Nrf2和Keap1 陽性率在不同腫物最大徑、浸潤深度中的表達差異有統計學意義，提示二者異常表達可以促進腫瘤的生長、局部侵襲和直接蔓延。Nrf2 和Keap1的異常表達與淋巴結轉移和遠處轉移有關，提示二者可能是促進腫瘤細胞遷移的重要因素。Nrf2 和Keap1 表達與TNM 分期有關，提示Nrf2 和Keap1 對判斷臨床分期可能有輔助意義，由于TNM 分期與腫瘤的生物學進展及判斷腫瘤的預后有關，因此Nrf2高表達和Keap1 低表達可能提示預后不良，生存分析的結果證實Nrf2 高表達、Keap1 低表達的患者預后差，與Nrf2、Keap1 與TNM 分期的關聯性結論一致。結果顯示，CRC 中Nrf2 和PCNA 具有正相關性，Keap1 和PCNA 具有負相關性，提示Nrf2 和Keap1均與PCNA 的表達具有協同作用，二者異常表達時可以促進腫瘤細胞的增殖，使細胞的增殖速度增加，細胞體積增大，細胞生長活躍[12-13]。Nrf2 和Keap1不僅在組織分化和器官的形成中可能有一定作用，還在正常組織的成熟中有一定價值，Nrf2 和Keap1異常表達可以調控多種促癌基因的表達，激活相關癌基因，如腫瘤壞死因子、Mum-1 等[14]。Nrf2 和Keap1還能作為E2F/Rb 的靶向因子，引起腫瘤細胞的異質性改變。Nrf2/Keap1 作為信號通路可以介導多種信號途徑，活化核因子等相關細胞分子病理通路，對腫瘤的遷移和血液供應進行有效調控[15]。Nrf2 和Keap1可能對TWIST 等上皮間質轉化的因子具有一定的調控作用，這可能是腫瘤進展中的促進因素。近年關注Nrf2/Keap1 在腫瘤治療靶點及治療干預作用，后續的臨床意義可能更明顯[16-17]。

總之，Nrf2 高表達、Keap1 低表達在CRC 的形成和進展有重要作用。Nrf2/Keap1 可能通過對細胞增殖的調節起協同作用，術后檢測腫瘤組織Nrf2 和Keap1 表達對判斷預后具有一定價值。