NEDD9表達下調對結腸癌生物學行為的影響

李豪杰 徐庭凱 王連迪

河南省漯河市郾城區人民醫院外二科1(462300) 心內科2

背景：NEDD9在細胞遷移、趨化、凋亡、細胞周期中發揮重要作用，NEDD9 siRNA可有效降低基因表達，并從不同水平上促進細胞凋亡、阻斷腫瘤細胞遷移和侵襲。目的：探討NEDD9在結腸癌組織中的表達以及siRNA干擾NEDD9表達對結腸癌Caco-2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。方法：收集2017年1月—2018年1月漯河市郾城區人民醫院確診的結腸癌組織和相應癌旁組織。常規培養結腸癌Caco-2細胞，采用LipofectamineTM 2000轉染細胞，并將細胞分為對照組、陰性對照組和siRNA干擾組。采用qRT-PCR法檢測結腸癌組織和細胞中NEDD9 mRNA表達，CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲，蛋白質印跡法檢測NEDD9、MMP-9、Bcl-2、Bax、TIMP1蛋白表達。結果：結腸癌組織NEDD9 mRNA表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。與對照組相比，siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，細胞增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制(P<0.05)，細胞凋亡增強(P<0.05)，NEDD9、MMP-9、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、TIMP1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。結論：NEDD9基因可通過凋亡相關基因Bcl-2和Bax以及侵襲相關基因MMP-9和TIMP1來調控結腸癌Caco-2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。

結腸癌為常見的惡性腫瘤，目前手術切除和化療是其主要的治療方法，但臨床療效并不理想，復發率較高，侵襲轉移是治療失敗和患者死亡的主要原因[1]。因此，早期準確診斷和及時治療尤其重要，但由于該病起病比較隱匿，早期無癥狀，早發現、早診斷和早治療存在一定難度[2]。探討結腸癌侵襲轉移相關的分子標志物并闡明其發生機制，對結腸癌的治療具有一定的意義[3]。神經前體細胞表達發育下調基因9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated gene 9, NEDD9)為Cas蛋白家族成員，在腫瘤細胞的侵襲、遷移、趨化、凋亡、細胞周期中發揮重要作用[4]，與患者預后的關系密切。研究表明，NEDD9參與了乳腺癌、胃癌、大腦膠質瘤、肺癌、胰腺癌、皮膚黑色素瘤等腫瘤的發生和進展[5-7]。結腸癌中NEDD9的相關研究較少，具體的作用機制亦尚未闡明。本研究通過檢測NEDD9在結腸癌組織中的表達，并采用siRNA干擾技術下調結腸癌細胞中NEDD9表達，旨在探討其對結腸癌侵襲轉移的影響。

材料與方法

一、主要材料與試劑

人結腸癌細胞Caco-2購于上海中國科學研究院細胞研究所；NEDD9 Human siRNA(OriGene公司)；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2×)(上海碧云天生物技術有限公司)；CCK-8(上海碧云天生物技術有限公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Transwell小室(美國Corning Costar公司)；兔抗人NEDD9、MMP-9、TIMP1抗體(Santa Cruz公司)；Bcl-2、Bax蛋白抗體、羊抗兔HRP標記的二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。

二、方法

1. 組織標本：選擇2017年1月—2018年1月漯河市郾城區人民醫院病理科術后診斷的16例結腸癌組織及其相應癌旁組織(距結腸腫瘤切緣>5 cm的正常結腸黏膜組織)，均于手術半小時內置于液氮罐中凍存。標本采集和使用均經患者知情同意，研究方案由漯河市郾城區人民醫院倫理委員會審批通過。

2. siRNA干擾序列的合成：共采用3對干擾序列。1號正義鏈：5’-UUA AGA CAG CAU UAA GCA CUG-3’，反義鏈：5’-GUG CUU AAU GCU GUC UUA ACU-3’；2號正義鏈：5’-UUU UCC UAC ACU AGU UAA GAC-3’，反義鏈：5’- CUU AAC UAG UGU AGG AAA ACG-3’；3號正義鏈：5’-UAU CAU AGA CGU CCU UUU GGU-3’，反義鏈：5’-CAA AAG GAC GUC UAU GAU AUC-3’；三條等量混合。僅含有NEDD9陰性序列的正義鏈：5’-GUA AUG ACA AUU AGA UCA CGC-3’，反義鏈：5’-UUG CGU AAU UGU GCA UCU AUC-3’。

3. 細胞分組和轉染：將細胞分為對照組(未作任何處理)、陰性對照組(僅含有NEDD9陰性序列)、siRNA干擾組(含有NEDD9基因干擾序列)。采用DMEM培養基，含10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，傳代。選擇對數生長期細胞接種于6孔板，當生長至70%左右時進行轉染，具體步驟按照LipofectamineTM2000說明書進行操作，轉染6 h后，改換含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。

4. qRT-PCR：收集結腸癌組織和細胞，以Trizol裂解并提取RNA，反轉錄生成 cDNA。采用Light Cycler?96實時熒光定量PCR儀(美國Roche公司)，引物序列由上海英駿生物技術有限公司合成。NEDD9(NM_001271033.1)上游序列：5’-CAC CGC AGT GCT TAA TGC TG-3’，下游序列：5’-GGG GGT TAT CAC CTT ATA CTT CAT-3’，產物大小87 bp；內參GAPDH(NM_001289745.2)上游序列：5’-GAA GAC GGG CGG AGA GAA AC-3’，下游序列：5’-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3’，長度117 bp。采用2-△△Ct法測定NEDD9 mRNA表達。

5. 細胞生長抑制實驗：采用CCK-8法檢測細胞增殖情況。將結腸癌Caco-2細胞以1×104個/mL密度接種于96孔板，每組設置3個復孔，轉染24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入CCK-8溶液 10 μL，培養2 h。于波長450 nm處測定吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線。

6. 流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數生長期結腸癌Caco-2細胞，轉染72 h后，胰酶消化，1 000×g離心5 min，收集細胞，PBS重懸計數。取5×104重懸細胞，1 000×g離心5 min，加入結合液500 μL重懸細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，然后加入PI 5 μL，混勻，室溫孵育10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

7. 細胞遷移實驗：細胞轉染72 h后，將密度為4×104的結腸癌Caco-2細胞100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基800 μL，培養24 h，以棉簽刮凈濾膜上層細胞，室溫甲醛固定10 min，Giemsa染色，拍照計數。

8. 細胞侵襲實驗：Transwell上室膜面鋪上Matrigel。細胞轉染72 h后，將密度為4×104的結腸癌Caco-2細胞100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基800 μL，培養24 h，以棉簽刮凈濾膜上層細胞，室溫甲醛固定10 min，Giemsa染色，拍照計數。

9. 蛋白質印跡法：收集轉染72 h的結腸癌Caco-2細胞，常規方法提取蛋白質，調整各樣本蛋白總量，行SDS-PAGE凝膠電泳，分別加入一抗(NEDD9、MMP-9、Bcl-2、Bax、TIMP1和β-actin的工作濃度均為1∶1 000)和HRP標記的二抗(工作濃度為 1∶1 000)，Bio-Rad凝膠成像系統成像拍照，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

三、統計學分析

結 果

一、NEDD9在結腸癌組織和細胞中的mRNA表達

結腸癌組織中NEDD9 mRNA表達顯著高于癌旁組織(1.712±0.374對0.732±0.512；t=2.947，P<0.05)。

結腸癌Caco-2細胞中，對照組、陰性對照組、siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達分別為1.513±0.259、1.506±0.217、0.704±0.158，三組間相比差異有統計學意義(F=117.85，P<0.05)。其中siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達顯著低于對照組(t=4.619，P<0.05)。

二、siRNA對結腸癌Caco-2細胞增殖的影響

與對照組相比，siRNA干擾組不同時間點的A值顯著降低(P<0.05)；而對照組與陰性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

三、siRNA對結腸癌Caco-2細胞凋亡的影響

圖1 siRNA對結腸癌Caco-2細胞增殖的影響(CCK-8法)

*與對照組比較，P<0.01

與對照組相比，siRNA干擾組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而對照組與陰性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

四、細胞遷移能力

與對照組相比，siRNA干擾組穿膜細胞數顯著降低(P<0.05)，而陰性對照組與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。

五、細胞侵襲能力

與對照組相比，siRNA干擾組穿膜細胞數顯著降低(P<0.05)，而陰性對照組與對照組穿膜細胞數相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖4)。

六、蛋白表達

與對照組相比，siRNA干擾組NEDD9、MMP-9、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、TIMP1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。而陰性對照組上述指標與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖5)。

*與對照組比較，P<0.05

*與對照組比較，P<0.05

*與對照組比較，P<0.05

討 論

NEDD9為一種骨架蛋白，對細胞凋亡、遷移、侵襲、趨化、周期以及分化具有特異性的調控作用，并與多個信號通路有聯系[8]。國內周森君[9]發現，NEDD9敲減后肝癌細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，而NEDD9過表達能增強肝癌細胞株遷移和侵襲能力。韋林等[10]的研究結果顯示，NEDD9在食管癌組織中特異性高表達，參與食管癌的侵襲、轉移，并與食管癌預后相關。Sima等[11]的研究發現，過表達NEDD9可通過酪氨酸磷酸化FAK和SRC促進宮頸癌的遷移和侵襲。本研究中，結腸癌組織NEDD9 mRNA表達明顯高于相應癌旁組織。細胞學實驗表明，結腸癌Caco-2細胞轉染NEDD9 siRNA后，NEDD9 mRNA表達較對照組明顯降低，細胞增殖明顯下降，凋亡率明顯增加。提示NEDD9表達可能與結腸癌的發生、進展有關。進一步行蛋白質印跡法發現，siRNA干擾72 h后，Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯增加。而Bcl-2、Bax水平及其比值對癌細胞接受凋亡信號起有關鍵作用，說明siRNA可能通過Bcl-2/Bax信號通路來調控細胞凋亡。

已有研究表明，腫瘤細胞外基質的消化與腫瘤侵襲有關。腫瘤細胞分泌的MMP家族成員可降解細胞外基質成分，而內源性TIMP1為MMP的重要抑制劑。因此，MMP-9和TIMP1表達變化是癌細胞遷移和侵襲的重要原因[12-13]。已有研究[14]表明，沉默NEDD9可下調MMP-9表達，進而抑制腫瘤的侵襲能力。本研究中，siRNA干擾NEDD9基因表達后，結腸癌Caco-2細胞遷移和侵襲能力明顯降低，且MMP-9表達明顯下調，TIMP1表達明顯上調。因此，降低NEDD9基因表達可進一步調控MMP-9和TIMP1表達，從而抑制Caco-2細胞的遷移和侵襲。

總之，沉默NEDD9基因可通過凋亡相關基因Bcl-2和Bax以及侵襲相關基因MMP-9和TIMP1來調控結腸癌Caco-2細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。故抑制NEDD9基因表達有望成為結腸癌基因治療的新策略。