細胞3D打印技術概述

趙雨

目前，英國有5 000多人在等待移植新的腎臟。在接下來的一年里，經過平均大約30個月的等待后，他們中只有不到一半的人會得到新的腎臟。其余的人將繼續等待，可他們不能永遠堅持下去： 2016年，457名英國人在等待新腎、新肝、新心臟或新肺的過程中死亡。另有875人由于已經病得無法接受移植手術而從候補名單上被除名。而在中國這種情況更為嚴重，據統計，中國的人體器官的供需比僅為1∶30，與英美發達國家的1∶3左右的供需比相差甚遠。在數以萬計的等待者中，每年僅有幾千名幸運兒可以接受器官移植。

1 生物3D打印技術簡介

如果科學家們不再依賴稀缺的捐贈器官，而是能夠在實驗室中快速、廉價地構建健康的新器官，并將患者自身的細胞作為原材料，那會怎樣 在過去的約15年里，這個夢想推動了在生物3D打印領域的投資和研究。生物3D打印技術是將生物單元（細胞/蛋白質/DNA等）和生物材料按仿生形態學， 生物結構或生物體功能， 細胞特定微環境等要求用“三維打印”的技術手段制造出具有個性化的體外三維結構模型或三維生物功能結構體。其科學研究、技術應用和產業化發展廣涵于生物3D打印裝備和生物墨水的研發及制造、高端醫療器械的制造、復雜組織工程支架制造、體外生物功能結構體的制造、生物/病理/藥理模型和新藥檢測模型制造等。

生物3D打印作為一門新興交叉前沿技術領域，目前在國內外得到前所未有的戰略關注， 如美國增材生物制造探討，歐盟《制造業的未來：2015～2020戰略報告》、“十三五”規劃綱要、國家科學技術部/工業和信息化部3D打印戰略規劃等均將以細胞和先進生物材料為基礎的生物制造和生物3D打印技術視為國家重要戰略發展方向。

2 生物3D打印技術的應用

根據所用生物材料性能的不同，清華大學生物3D打印中心將目前生物3D打印技術分為4個層次。

第1層次是打印無生物相容性要求的材料，可應用于3D打印體外病例模型、手術導板、3D打印體外假肢或矯形輔具等領域，該層次的應用極大地發揮了3D打印在個性化定制方面的優勢，幫助相關病人量身定做相關手術模型或治療工具，可使病人得到更好的治療。

第2層次是打印具有生物相容性，但非降解材料。此類打印產品可以作為體內永久植入物，材料可以是鈦合金等金屬等材料，也可以是高分子等惰性材料等，其中3D打印金屬植入物廠商愛康醫療已獲得多個CFDA上市許可證書，產品已應用于臨床。

第3層次是打印具有良好生物相容性且可降解的生物材料，主要的應用領域為打印組織工程支架。其要求打印的體內植入物不僅能與體內相容，還要具有降解特性，在體內一定時間促進體內缺損組織的生長和愈合。由清華大學生物制造中心獨創的3D打印低溫沉積制造技術集成了生物3D打印與冷凍干燥微觀制孔技術的優勢，可實現同時具有宏觀可控孔隙（百微米級）與微觀微絲孔隙（十微米級）的組織工程支架的3D打印，提高了支架內的細胞種植率，更利于細胞在支架內部的生長和組織功能的實現，并在骨組織工程支架等領域應用良好，并已開始向臨床轉化。

第4層次是打印活性細胞，蛋白及其他生物活性分子等，該層次的生物3D打印技術也被稱作細胞3D打印技術。細胞3D打印技術可以直接將細胞、蛋白及其他具有生物活性的材料（例如蛋白質，DNA，生長因子等）作為3D打印的基本單元，以3D打印的方式，直接構建體外生物結構體、組織或器官模型。

3 細胞3D打印的技術挑戰

細胞3D打印技術是目前生物3D打印技術的最前沿技術，也是實現器官打印的最大潛在技術。打印過程中，細胞必將承受一定的機械力，甚至造成一定損傷，因此，細胞3D打印技術的實現充滿了各種技術挑戰，細胞3D打印的技術挑戰主要包括以下幾個方面。

3.1 材料能否打印

首先要選擇能被生物3D打印機打印的生物材料/生物墨水，雖然不同的打印工藝對生物墨水粘度有不同要求，但總體來講，太低粘度或太高粘度的生物墨水，都很難被打印。因此，細胞3D打印的第一個挑戰是要找到可以被打印的生物墨水。

3.2 能否構建3D結構

并不是所有被打印的生物墨水都可以構建3D結構，為了打印出具有高分辨率的3D復雜細胞結構體，細胞打印墨水需滿足通過提高打印墨水的粘度來提高生物墨水的凝膠能力，以維持層層堆積結構體的力學性能。

3.3 細胞能否存活

增加細胞打印墨水的粘度，會導致打印過程中細胞打印墨水中的細胞所承受的剪切力增加，從而導致打印后細胞存活率的下降。因此，控制好打印過程中細胞打印墨水的粘度（既不能太高也不能太低），尋找細胞打印墨水的合適粘彈性區間，是實現良好細胞三維打印（良好的成形性能與生物學性能）的重要步驟。

3.4 是否具有功能性

剛打印的3D細胞結構體，只是細胞和生物材料的3D組合體，并沒有形成組織特征。因此，打印的3D細胞結構體，必須經過適宜的培養條件，才能形成組織功能性。此環節需要保證，生物材料的生物相容性，力學性能和功能性，培養基的充足供應和廢物的充分排出等。甚至有些組織需要特定的生物反應器，通過流體，力或電的刺激才能達到其功能性。

綜上所述，細胞3D打印的各個環節充滿了不同甚至具有一定相互矛盾的技術挑戰，需要多學科的交叉背景知識和多年的經驗積累去解決。

4 細胞3D打印技術分類

其根據其離散細胞墨水的方法主要可以分為5類（表1）。

4.1 噴墨式細胞打印技術

噴墨式細胞打印是基于普通噴墨打印機的打印原理，利用熱氣泡或壓電的體積變化，擠壓墨盒內的細胞墨水，離散產生含有細胞的細胞墨水的微滴并噴射出去[1]。噴墨打印機的噴嘴直徑僅有幾十微米，可以進行高精度的細胞打印，但是也由于其噴嘴直徑比較小，噴墨式細胞打印難以離散打印高粘度的細胞墨水，使得此技術直接打印三維生物學實體模型較困難；此外，熱氣泡的產生和壓電的變形會對細胞造成一定損傷，需較好的控制打印工藝參數。代表性研究機構有德州大學的Boland教授課題組。

4.2 微擠出式細胞三維打印技術

微擠出式細胞三維打印技術，利用機械力或氣壓等驅動力，直接通過微噴頭連續擠出生物材料和細胞構建三維生物學結構體[2，3]。由于常用的微擠出式細胞打印機的噴嘴直徑多在百微米級，打印精度一般，但其擠出式的工藝可以打印高粘彈性的生物墨水，易于實現三維生物學實體的構建。此外，此技術在犧牲精度的同時，使得打印出的每一個離散單元體積變大，間接地提高了打印效率和細胞存活率。代表的研究機構有清華大學生物制造中心的孫偉教授課題組，美國哈佛大學的Jennifer Lewis教授課題組。

4.3 激光直寫式細胞打印技術

激光直寫式細胞打印技術，是指利用光壓力控制細胞排列成具有高精度的空間結構，其精度可達單細胞量級，但提高的精度也導致成形效率下降明顯，該工藝也難以打印粘度較高的生物材料，使得其打印三維生物學結構體的能力降低[4]。代表的研究機構有美國明尼蘇達大學的David Odde教授課題組。

4.4 立體光刻細胞三維打印技術

立體光刻細胞三維打印技術，通過激光或紫外光在空間的掃描運動實現對含有細胞的光刻膠的立體固化成形，制造出預設計的三維生物學結構[5]。雖然這種技術具有高度的柔性，但其成型效率卻不如人意。部分開發者不再利用激光細小的光斑掃描立體固化成形，而是利用投影機原理，進行面投射，每層同時固化成形。該工藝根據投影機類型主要可以分為液晶投影儀型和數字微鏡（Digital Micromirror Devices，DMD）投影儀型，兩者的本質區別是液晶投影儀首先將光源分解成3種單色光，再分別通過3個液晶片控制3種單色光的亮度，最終合成所需的光和圖案，而DMD只是利用一個可以反射光源的數字陣列式微鏡來實現。該種工藝的光敏水凝膠預先存儲在成形室內，會造成材料浪費，以及難以制造多種細胞的異質結構，且光敏水凝膠多具有不同程度的毒性，使得該種工藝的細胞存活率一般。代表的研究機構有美國加州大學圣地亞哥分校的Chen Shaochen課題組。

4.5 聲波驅動式細胞打印技術

聲波驅動式細胞打印技術是利用聲波的振動產生微滴噴射的方法，其精度最小可達10μm左右，但該工藝也是微滴噴射的方法，難以噴射高粘度的生物材料，使得打印三維生物學結構體的能力受到限制[6]。代表的研究機構有美國Stanford大學的Demirci教授課題組。

綜上所述，各種細胞打印方法各有所長，但對于具有三維復雜異質生物學結構體來說，微擠出式細胞三維打印技術更為合適，其構建多細胞三維模型更容易，效率更高，細胞存活率高，打印精度（百微米級）也能滿足一般科研使用需求。所以，目前市場上主流的細胞3D打印機多是基于該技術實現，代表公司有德國Envision TEC公司、瑞士Regen Hu公司，國內的上普博源（北京）生物科技有限公司（SunP Biotech）、捷諾飛生物科技股份有限公司等。

5 細胞3D打印的生物墨水分類

微擠出式細胞三維打印的生物墨水有很多種，根據其溶膠-凝膠固化轉變原理可以分為以下幾種方式（表2）。

5.1 溫敏水凝膠生物墨水

溫敏水凝膠生物墨水可以通過環境溫度的改變實現其溶膠-凝膠方式的轉變。凝膠-溶膠轉變溫度在0～37℃之間且生物相容性好的水凝膠材料均有能力作為細胞打印墨水[7]。最具代表性的溫敏水凝膠細胞打印墨水為明膠。溫敏水凝膠的溶膠到凝膠的轉變方式一般為可逆的，且只要材料溫度達到轉變溫度即可轉變，無需使用液體交聯劑，不受交聯劑滲透深度影響，也不易出現液體交聯劑導致三維打印離散層層堆積時，層與層之間出現的層間剝離現象，易于構建大尺寸的三維細胞結構體。

5.2 離子交聯式生物墨水

以海藻酸鈉[8]為代表的水凝膠材料，可以通過與離子溶液相接觸的方式進行交聯固化，實現溶膠-凝膠方式的轉變。但是此種離子置換的交聯方式反應很快，難以利用生物墨水與交聯劑預混合的方式打印，一般只能利用含離子的液體進行浸泡或噴射在生物墨水表面進行交聯。但細胞三維打印機若使用液體浸泡的方式進行交聯，易出現前文提到的層間剝離現象，不利于打印三維生物學結構體。

5.3 酶促交聯式生物墨水

以纖維蛋白原[9]為代表的水凝膠材料，可以通過與生物酶相接觸的方式進行交聯，實現溶膠-凝膠方式的轉變。此種酶促交聯方式一般反應較慢，生物酶可以混入液體制成交聯劑，通過液體浸泡的方式進行交聯，也可以與水凝膠生物墨水預混合后，待時間孵育交聯。但溶膠到凝膠轉變反應慢，也增加了成形難度，不易于直接打印三維結構體。

5.4 紫外光固化

部分合水凝膠材料經過合成改性，再加入光引發劑，使得水凝膠生物墨水具有光敏特性，可以通過紫外光進行交聯固化（例如GelMA[10]等）。光敏水凝膠一般強度高，紫外光的滲透深度比一般液體交聯劑的滲透深度更深，但光引發劑的引入，會降低生物墨水的生物活性。

6 細胞3D打印的未來

盡管目前細胞3D打印已能打印多種細胞，甚至可以構建一些簡單的組織等，但其距離器官打印還有一段距離，未來值得關注一下幾方面的研究突破或趨勢變化，以促進細胞3D打印技術的向前發展。

6.1 研究新型生物墨水

目前，尚不存在理想型的生物墨水。基于天然生物材料的墨水生物相容性好，但大多難以打印或力學性能不好。基于人工合成高分子材料的墨水打印性能或力學性能較好，但生物活性一般較差，甚至有些材料沒有經過FDA認證。未來，研發打印性能和生物學性能兼優的生物墨水將是行業不可避免的趨勢。

6.2 產業化促進整個領域快速向前

隨著生物3D打印產業化的不斷成熟，越來越多的廠商開始開發商業化的生物3D打印機，生物3D打印機的功能越來越強大，價格越來越低廉。這使得新進入這個交叉領域的研究者，尤其是材料學家，生物學家，醫生等非機械電子專業的研究者，可以無需花精力在自己不擅長的打印機開發領域，而專注于生物墨水的研發及組織或器官的構建研究。因此，細胞3D打印機的產業化正在促進這個領域更快的發展。

6.3 提供細胞3D打印的專業化服務將是未來的趨勢

細胞3D打印的交叉學科特性及技術挑戰，決定了其入門具有一定的門檻。因此，通過與有經驗的科研機構合作，或尋找有經驗的公司進行技術服務，將是此領域新入門者快速獲取知識并取得科研成果的便捷途徑。據此預測，具有高校研究背景的細胞3D打印的專業化服務公司將會越來越多。

7 結語

近年，細胞3D打印技術隨著生物3D打印機和生物墨水的產業化已走進越來越多的實驗室，更多的交叉領域研究者一起投身到這個實現人類器官再造夢想的領域。相信隨著細胞3D打印領域的不斷蓬勃發展，實現器官打印的那天也不會太遙遠。

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