金銀花細胞懸浮培養體系的建立研究

祖恩凡 趙晨晨 張凌霄 錢晶晶

摘要：以金銀花脫毒苗為試材，研究了外植體、培養基對金銀花疏松愈傷組織的誘導以及懸浮培養液中激素種類及其濃度和初始接種量對金銀花懸浮細胞生長的影響。結果表明：幼葉最易誘導愈傷組織;細胞懸浮培養最佳培養液為：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 m01L;最佳初始接種量為60g/L。

關鍵詞：金銀花;疏松愈傷組織;細胞懸浮培養

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物，有研究指出，金銀花含有大量化學成分，如揮發油中多有不飽和烯萜類和芳香醇類物質、有機酸類、黃酮類和皂苷等。金銀花含有大量的化學成分，具有清熱解毒、疏散風熱的功能，用于治療溫病發熱、風熱感冒、咽喉腫痛、肺炎、丹毒、蜂窩狀組織炎和痢疾等多種疾病，為臨床最常用中藥之一。金銀花作為食品、飲品應用廣泛，且市場前景廣闊。近年來，大部分提取物都是采用金銀花植物提取，若采用人工栽培方式培育，生長周期相對較長;而植物組織或細胞培養具有不受環境和季節影響、培養周期短等優點。

1材料與方法

1.1試驗材料

外植體來源于安徽科技學院種植基地，采集健壯的無病蟲害金銀花的新生嫩莖，去除葉片作為外植體，用流水沖洗10min后備用。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒。放入外植體，用無菌水沖洗3～4次。將外植體放入超凈工作臺中，用無菌水沖洗3次，分別用雙氧水中浸泡消毒7min，再用無菌水沖洗5次，最后將沖洗好的材料放于濾紙上備用。

1.2.2愈傷組織誘導。將莖切成小段，處理葉片時則在葉脈處輕輕劃上3～4道傷口，而后將截面朝向培養基，固體培養基均為：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.2mg/L。l周后，比較不同外植體誘導形成的愈傷組織性狀及生長狀況。試驗中不同外植體接種為一組試驗，每組做3個重復，取平均數繪制生長曲線。

1.2.3誘導率與褐化率的統計。誘導率（%）=形成愈傷組織的外植體塊數/接種外植體塊數×100;褐化率（%）=褐化愈傷組織塊數/愈傷組織總數×100。

1.2.4細胞懸浮培養。繼代2次后，選擇生長旺盛、結構疏松的愈傷組織塊，用鑷子夾碎或用小刀分割得到愈傷組織碎塊，轉移到裝有MS液體培養基的三角瓶中進行懸浮培養，置于搖床內110r/min，26～C振蕩培養，每7d繼代1次，繼代時培養物用200目的滅菌細胞篩過濾，除去大細胞團和殘渣，得到一定體積的小細胞團或單細胞懸浮液。試驗過程中采用不同激素（6 BA、NAA和2，4-D）及不同濃度的組合（表2）比較不同激素及濃度處理對金銀花懸浮細胞生長的影響。建立金銀花細胞懸浮體系最優培養體系。試驗中不同激素組合為一組試驗，每組做3個重復，取平均數繪制生長曲線。

1.2.5接種量對金銀花懸浮細胞生長的影響。選取起始接種量4，6，8g，L，研究不同接種量對金銀花懸浮細胞生長的影響。每3d觀察生長情況，并分別取得細胞稱鮮重。試驗中每個接種量為一組實驗，每組做3個重復，取平均數繪制生長曲線。

2結果與分析

2.1外植體對愈傷組織誘導的影響

表1數據中顯示，幼葉誘導形成的愈傷組織較為疏松，生長較快，褐化率較低;老葉誘導形成的愈傷組織也較為疏松，褐化率低，但生長緩慢;而嫩莖誘導形成的愈傷組織較為堅硬，褐化率高。因此該試驗選擇金銀花的幼葉作為外植體。

2.2激素對金銀花細胞培養誘導的影響

由表2可知，不同的激素種類和不同濃度配比對金銀花愈傷組織的誘導有明顯的影響。6-BA含量越高誘導的細胞懸浮液顏色越綠，且分散性不好，不適合細胞懸浮培養。而2，4-D含量較高的組合中誘導的培養液顏色為黃色，分散性較好。

試驗顯示，MS+6-BA 0.6 mg，L+NAA 0.5 mg/L+0.2 mg，L是金銀花細胞懸浮適合的激素組合。

2.3金銀花細胞懸浮培養

金銀花細胞懸浮培養采用的液體培養基激素配比與誘導愈傷的固體培養基相同。結果發現，細胞生長經歷了4個階段：遲滯期、快速生長期、平衡期和衰亡期，表現為典型的S形生長曲線。液體懸浮培養條件下，細胞的生長周期為15d（圖1）。

2.4初始接種量對金銀花懸浮細胞生長的影響

初始接種量對金銀花細胞懸浮培養的影響，初始接種量按每瓶（25mL培養液）接種鮮重1、1.5、2g的愈傷組織，接種于液體培養基中，使細胞培養液濃度為40、60、80g/L。

圖1顯示，接種量較低時細胞的生長較為緩慢，接種量高時細胞出現了褐化死亡，培養液變為褐色。而接種量為低處理組的生長期最長，細胞生長量最大。

初始接種量對細胞的增殖有明顯的影響，初始接種量達到一定的值后細胞才能增殖，這是由于植物細胞的群集效應而引起的;另一方面，接種量過高則細胞密度大，導致培養液中的養分很快被耗盡，同時容易積累有害物質，最終導致細胞衰老，細胞的生長量隨即逐漸減少。該研究結果表明，60g/L為金銀花細胞懸浮培養最適初始接種量。

3結論與討論

金銀花為我國傳統中藥材，其歷史悠久。目前，對于金銀花無性繁殖的文章中涉及組織培養的研究較多，未查閱到金銀花細胞懸浮培養的相關文獻。本試驗采用MS基礎培養基，通過外植體選擇、激素選擇和起始接種量的研究初步建立起了金銀花細胞懸浮體系。試驗中，最適外植體為金銀花幼葉;最適懸浮培液為：MS+6-BA 0.6 mg/+NAA 0.5 mg/L+0.2mg/L，最佳起始接種量為60gL。

通過本次試驗建立起金銀花細胞懸浮培養體系并為今后的金銀花細胞產物提取打下基礎。