一種以海藻酸鈉、羧甲基纖維素為主要成分的止血微球的皮膚致敏、皮內反應和溶血試驗研究

袁麗欣 徐煒區 林柏佑 臧德躍

摘要：?目的：對一種以海藻酸鈉、羧甲基纖維素為主要成分的止血微球進行皮膚致敏、皮內反應和溶血試驗研究，為該種止血微球在醫學臨床使用提供生物安全依據。方法：根據GB-T 16886中豚鼠最大劑量試驗、動物皮內反應試驗和與血液相互作用試驗選擇的要求進行試驗。結果：皮膚致敏試驗動物在觀察期內致敏反應等級均為0;皮內反應試驗動物在觀察期內的反應均為無紅斑、無水腫;溶血率為0.9%。結論：該種止血微球無致敏反應和皮內反應，溶血率符合標準要求范圍內，可進一步用于臨床研究。

關鍵詞：止血微球 皮膚致敏 皮內反應 溶血

【中圖分類號】R322 ???【文獻標識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）04-241-04

止血對術中減少失血、保持術中視野清晰、防止重要組織損傷、保證手術安全以及術后創口愈合等均有重要意義，止血微球可用于各種復雜、大面積、噴射狀出血的迅速止血，顆粒狀分子迅速吸收血液中的水分^【1】，并將血液中有形成分（如血小板、紅細胞、白蛋白、凝血酶和纖維蛋白等）聚集在顆粒表面，形成一種凝膠混合物，達到即刻止血的功效。目前市面上大部分止血微球產品以殼聚糖為主要成分，本文所研究的止血微球主要成分為海藻酸鈉、羧甲基纖維素，海藻酸鈉是來源于褐藻中的一種海藻多糖，由于其強成膠性能，可在傷口表面形成凝膠，減輕病人的疼痛和預防傷口的二次出血^【2】;羧甲基纖維素是天然纖維素與氯乙酸經化學改性得到的一種衍生物，其水溶液具有增稠、成膜、黏結、水分保持、膠體保護、乳化等作用^【3】。由于該成分的止血微球作為一種表面接觸醫療器械，直接用于出血體表，不僅需要具有良好的止血性能，還需要良好的生物相容性，生物相容性是指生物醫用材料與人體之間相互作用產生的各種生物、物理、化學反應的性質，包括組織相容性、力學相容性、血液相容性以及免疫相容性等方面，是評價生物材料安全性與功能性的重要指標，也是生物材料研究中始終貫穿的主題^【4】。本文主要對該產品生物相容性中的皮膚致敏、皮內反應及溶血的作出試驗研究，皮膚致敏試驗采用最大劑量法，最大劑量法為最敏感的方法^【5】，皮內試驗通過皮內注射材料浸提液，對材料在試驗條件下產生刺激反應的潛能做出評定;溶血被認為是一種重要的反映材料與血液相互作用的篩選試驗^【6】。通過以上三個試驗對主要成分為海藻酸鈉、羧甲基纖維素的止血微球進行評價，為該產品的發展及其在生物臨床應用中提供安全可靠的依據。

1試驗材料

1.1試驗樣品

試驗樣品為止血微球，在無菌操作下，根據廠家提供該樣品的無膨脹吸收量，加入相應生理鹽水后充分溶脹后，根據GB16886.12的標準要求加入相應浸提介質，輕輕振搖，將微球充分浸泡在并均勻分散在浸提介質中，置37℃恒溫烘箱中浸提72小時，72小時后將浸提液和浸泡后的微球全部轉移到離心管中，2646×g離心10分鐘，取浸提液上清經0.22μm有機濾膜過濾后作為試驗的樣品溶液。

1.2試驗體系

普通級白化豚鼠50只，雌雄兼用，雌鼠未產并無孕，體重范圍：300g～400g，動物來源，廣州市花都區花東信華試驗動物養殖場生產許可證號：SCXK（粵）2014-0023;

新西蘭兔，體重范圍：2.5kg～2.8kg，動物來源：廣東省醫學試驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002。

試驗動物管理按照ISO 10993-2的規定進行，每天供給由廣東省醫學試驗動物中心提供的飼料，給予合格生活飲用水。監測每日的室溫，并將溫度范圍控制在20℃～26℃之間。監測每日的室內濕度，相對濕度控制在40%～70%范圍。

1.3主要試劑

精制棉籽油：ACROS公司;0.9%氯化鈉注射液：四川科倫藥業股份有限公司;弗氏完全佐劑：SIGMA公司;二硝基氯苯溶液：阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4主要儀器

電子天平（島津 UX4200H）、鼓風恒溫烘箱（BINDER FD115）、細胞離心機（貝克曼庫爾特 Allegra X-12R）、紫外可見分光光度計（島津 UV-2600）、恒溫水浴鍋（Memmert WNB29）

2.試驗方法

2.1皮膚致敏試驗

備皮：取上述豚鼠50只，在試驗前4h將動物背部4cm×6cm被毛除去，隨機分成5組，極性浸提液組10只，極性對照組10只;非極性浸提液組10只，非極性對照組10只;陽性對照組10只。

皮內誘導：按圖1 所示，在每只動物去毛的肩胛骨內側部位成對皮內注射0.1mL。

1—頭部 ???2—0.1mL皮內注射點 ???3—去毛的肩胛骨內側部位 ???4—尾部

部位A：注射弗氏完全佐劑與浸提介質以50：50（體積比）比例混合的穩定性乳化劑。

部位B：注射試驗樣品浸提液;陰性及陽性對照組動物分別注射相應對照液。

部位C：注射試驗樣品浸提液以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑和浸提介質（50%）配制成的穩定性乳化劑混合液;陰性及陽性對照組動物分別注射相應對照溶液以50：50的體積比例與佐劑配制成的乳化劑。

局部誘導：皮內誘導階段后6d，試驗區用10%十二烷基硫酸鈉按摩導入皮膚。24h后，采用面積約8cm²的吸收性紗布塊分別置于試驗樣品浸提液、陰性對照液及陽性對照液中浸透后，分別局部貼敷于每只動物的肩胛骨內側部位，覆蓋誘導注射點。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于48h后除去包扎帶和敷貼片。

激發：局部誘導階段后15d，將約2.5cm×2.5cm大小的吸收性紗布塊分別置于試驗樣品浸提液、陰性對照液及陽性對照液中浸透后，分別局部貼敷于誘導階段未試驗部位（每只動物的上腹部）。用封閉式包扎帶固定，并于24h后除去包扎帶和敷貼片。

觀察：除去敷貼片后24h和48h觀察試驗組和對照組動物激發部位皮膚，參照GB/T 16886.10 Magnusson和Kligman分級標準（見表1 示）對每一激發部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行分級并記錄。

結果評價：陰性對照組動物等級小于1，而樣品組中等級大于或等于1時一般提示致敏。如陰性對照組動物等級大于或等于1時，樣品組動物反應超過陰性對照組中最嚴重的反應則認為致敏。

2.2皮內反應試驗

備皮：取健康家兔3只，試驗前4h在脊柱兩側各剪剃約10cm×15cm區域兔毛，盡量避免機械損傷皮膚，以備注射浸提液。

給藥：在每只兔脊柱一側的前5個點皮內注射0.2mL極性溶劑制備的樣品浸提液，同一側的后5個點皮內注射0.2mL非極性溶劑制備的樣品浸提液;在每只兔脊柱另一側的前5個點皮內注射0.2mL極性溶劑對照液，同一側的后5個點皮內注射0.2mL非極性溶劑對照液（見圖2示）。

1-頭端 ???2-0.2mL極性浸提液注射點

3-0.2mL非極性浸提液注射點

4-0.2mL極性溶劑對照液注射點

5-0.2mL非極性溶劑對照液注射點 ??6-尾端

觀察：注射后即刻以及24h、48h和72h觀察和記錄各注射部位狀況，根據GB/T 16886.10-2017/ISO 10993-10：2010《醫療器械生物學評價 第10部分：刺激與皮膚致敏試驗》動物皮內反應試驗記分系統（見表2）對每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應評分，并記錄試驗結果。在72h評分后，分別將每只動物試驗樣品或空白對照的24h、48h和72h的全部紅斑與水腫記分相加，再除以15[3（記分時間點）×5（試驗樣品或空白對照注射點）]，計算出每只動物試驗樣品或空白對照的記分。三只動物記分相加后除以3得出每一試驗樣品和相應空白對照的總平均記分。試驗樣品記分減去空白對照記分可得出試驗樣品最終記分。如試驗樣品最終記分不大于1.0，則符合該試驗要求。

2.3溶血試驗

兔血制備

由健康家兔心臟采血10mL，加質量濃度20g/L草酸鉀溶液0.5mL，制備成新鮮抗凝兔血。取新鮮抗凝兔血8mL，加質量濃度9g/L氯化鈉注射液10mL稀釋備用。

血液與被測樣品的相互作用

在無菌操作下，分別取樣品10mL至3支試管中，作為樣品組;陰性對照組3支試管，每管加入10mL0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組3支試管，每管加入蒸餾水10mL。

全部試管放入37℃恒溫水浴中保溫30min后，每支試管加入0.2mL稀釋兔血，輕輕混勻，置37℃水浴中繼續保溫60min。

倒出管內液體以800g離心5min，吸取上清液移入比色皿內，用紫外分光光度計在545nm波長處測定吸光度。

根據測得的吸光度計算樣品的溶血率。

A_TS-A_NC

溶血率（%）= ——————×100%

A_PC-A_NC

式中：A_TS—樣品組吸光度

A_NC—陰性對照組吸光度

A_PC—陽性對照組吸光度

陰性對照管的吸光度應不大于0.03;陽性對照管的吸光度應為0.8±0.3。

3.試驗結果

3.1皮膚致敏結果

陰性對照組、樣品組動物在觀察期內致敏反應等級均為0，陽性對照組動物在觀察期內致敏反應等級為2～3。（詳見表3）

3.2皮內反應試驗結果

樣品組和對照組動物在觀察期內的反應均為無紅斑、無水腫，樣品組和對照組的總平均記分之差為0。（詳見表4）

3.3溶血試驗結果

樣品組和對照組的試驗數據見表5。樣品的溶血率為0.9%。

4.討論

在本試驗條件中，以海藻酸鈉、羧甲基纖維素為主要成分的止血微球所制備的浸提液在皮膚致敏反應試驗（最大劑量法）中，根據Magnusson和Kligman分級標準，樣品浸提液組未見引起皮膚致敏反應，而涂抹2，4-而硝基氯苯的陽性對照組豚鼠均產生2～3級反應;皮內反應試驗無紅斑、無水腫現象出現;溶血率為0.9%，符合標準要求范圍內。綜上所述，該成分的止血微球在皮膚致敏、皮內反應試驗、溶血試驗中均有較好安全性，可進一步用于臨床研究。

參考文獻

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