精子染色質(zhì)擴散實驗檢測精子DNA完整性的臨床價值

陳峰

摘要：目的：通過比較男性不育患者和正常生育男性的精子DNA完整性，比較其差異，探討精子DNA完整性與男性不育的關(guān)系，并建立SCD試驗檢測精子DNA完整性參考值。方法：對62例志愿者的精液和87例不育患者的精液，應(yīng)用精子染色質(zhì)擴散（Sperm Chromatin Dispersion，SCD）試驗方法檢測精子DNA完整性。應(yīng)用受試者工作特征曲線（Receive Operating Characteristic Curve，ROC曲線），確立SCD試驗的截斷點。結(jié)果：男性不育患者DNA損傷精子的百分率（29.4%±12.4%），較對照組的（12.9%±4.4%）明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。最大Youden指數(shù)為0.682，以DNA碎片精子百分率<20.2%為診斷界值，在ROC曲線下方的面積為0.923，靈敏度約為74.7%，特異度約為93.5%結(jié)論：精子DNA完整性異常男性不育有關(guān)。鑒別不育患者與正常生育男性精子DNA碎片的閾值為20.2%，建議低于20%的DNA碎片精子百分率為正常參考值。

關(guān)鍵詞：男性不育;精子;DNA損傷

【中圖分類號】R134 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）04-127-02

目前，全球約有 8 000萬對夫婦患有不育癥，且發(fā)生率逐年增加^[1]。已婚夫婦不育癥發(fā)病率約為15%，其中男性不育癥發(fā)病率高達(dá)30%^[2]。由于男性不育的病因復(fù)雜，診斷較為困難，約有1/3男性不育患者常規(guī)精液分析結(jié)果為正常或接近正常^[3]。單憑精液常規(guī)檢測往往不能滿足臨床診治的需要^[4]。因此，男性不育診斷的重點應(yīng)從常規(guī)的精液檢查向高層次的分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和生殖免疫學(xué)檢查發(fā)展。

本研究擬應(yīng)用SCD試驗檢測精子DNA碎片，比較健康生育男性與臨床不育男性精子DNA完整性的差異性，應(yīng)用受試者特征曲線（Receiver Operating Characteristic Curves， ROC曲線），分析精子DNA碎片對不育患者的診斷價值，探討其臨床應(yīng)用價值。

材料與方法

一、研究對象

在山東省新泰市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心2014年8月至2015年12月就診的87例不育患者為不育組，平均年齡34.7±3.9歲（26～43歲）。正常對照組為62名近期生育過的健康成年男性，平均年齡33.8±4.9歲（23～42歲）。所有入選對象均已簽署知情同意書。

二、方法

㈠儀器和試劑：OLYMPUS CX31普通光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。低溶點瓊脂、標(biāo)準(zhǔn)瓊脂、二硫蘇糖醇（DTT）、三羥甲基氨基甲烷-硼酸鹽-乙二胺四乙酸二鈉鹽（TBE）緩沖液等均為美國Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

㈡ 精液常規(guī)分析：按照WHO《人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》精液變量參考值的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

㈢ 精子處理：將精液標(biāo)本用HTF洗滌2次后，調(diào)密度至10-20×10⁶/ml，與1%低熔點瓊脂凝膠（1：2.5）混勻，37℃孵育5 min，滴在經(jīng)過0.65%標(biāo)準(zhǔn)瓊脂預(yù)處理過的載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃放置5 min。

㈣ SCD實驗：

（1）方法：移走蓋玻片，室溫下浸入0.08 mol/L的鹽酸（HCl）內(nèi)7 min;浸入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液內(nèi)20 min;移入TBE緩沖液中3 min;常規(guī)乙醇脫水。所有操作過程要求標(biāo)本載玻片處于水平狀態(tài)。

（2）Diff-Quik法染色^[3]，普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

（3） 結(jié)果判斷：每張標(biāo)本隨機觀察至少500個精子。大暈環(huán)和中暈環(huán)表示精子DNA完整無碎片，小暈環(huán)、無暈環(huán)及退化表示精子DNA斷裂為碎片。計數(shù)DNA損傷精子數(shù)和精子總數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，精子DNA碎片百分率、精液常規(guī)參數(shù)呈正態(tài)分布，精液常規(guī)分析數(shù)據(jù)、SCD檢測精子DNA碎片數(shù)據(jù)均以±s表達(dá);生育組和不育組精子DNA碎片、精液常規(guī)參數(shù)的比較采用獨立樣本的t檢驗。通過多元線性回歸，分析各常規(guī)精液參數(shù)與精子DNA完整性的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用ROC分析，確立精子DNA碎片的正常值。

結(jié)果

精液常規(guī)分析及精子DNA完整性檢測結(jié)果如表1所示。不育組精子密度、精子活動率、精子形態(tài)及與生育組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。DNA損傷精子百分率的均數(shù)在不育組和生育組分別為（29.4±7.3）%和 （12.9±4.4）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

為探討常規(guī)精液參數(shù)與精子DNA完整性的關(guān)系，應(yīng)用多元線性回歸分析。如表2所示，精液常規(guī)參數(shù)中，精子密度和精子活動力即前向運動精子DNA損傷精子百分率密切相關(guān)（P<0.05）。而患者年齡、精子形態(tài)與DNA損傷精子百分率不相關(guān)（P>0.05）。

SCD試驗檢測精子DNA碎片的ROC曲線，見圖1。男性不育截斷點在精子DNA碎片20.2%處，靈敏度約為74.7%，特異度約為93.5%，獲得最大Youden指數(shù)。從圖1可見，SCD試驗檢測精子DNA完整性異常導(dǎo)致男性不育的最佳截斷點為20.2%，曲線下面積（AUC）為0.923，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

討論

一、精子DNA損傷與男性不育的關(guān)系

在精子發(fā)生過程中，?如果精蛋白替代組蛋白出現(xiàn)異常，就會導(dǎo)致精子單鏈和雙鏈DNA斷裂，精核DNA損傷^[5]。本研究中結(jié)果顯示，不育患者DNA損傷精子百分率大大高于正常生育男性的DNA損傷精子百分率，這與多項類似研究的結(jié)論一致。有研究認(rèn)為多數(shù)情況下，精液分析結(jié)果異常標(biāo)本其精子損傷往往比較嚴(yán)重，不育患者精子DNA變性程度明顯高于正常生育者，精液常規(guī)參數(shù)（精子密度、活率和形態(tài)學(xué)）分析得到的精子質(zhì)量與精子DNA損傷之間呈顯著負(fù)相關(guān)，而且不育患者中精液參數(shù)正常者精子碎片程度顯著低于異常者。在本研究中，精液常規(guī)參數(shù)中，精子密度和精子活動力即前向運動精子DNA損傷精子百分率密切相關(guān)（P<0.05）。而患者年齡、精子形態(tài)與DNA損傷精子百分率不相關(guān)（P>0.05）。精子DNA完整性是一種較好的男性生育預(yù)測指標(biāo)。

二、SCD試驗檢測精子DNA完整性的臨床價值

ROC曲線是對檢驗項目臨床應(yīng)用性能評價的定量資料進(jìn)行歸納分析的最常用的統(tǒng)計方法之一，被公認(rèn)為衡量診斷信息和診斷決策質(zhì)量的最佳方法，本研究應(yīng)用ROC曲線進(jìn)行對SCD的診斷結(jié)果進(jìn)行評價。ROC曲線下面積為0.923，提示SCD在評價男性生育能力方面具有較高的診斷價值。在截斷點20.2%處，靈敏度約為74.7%，特異度約為93.5%，獲得最大Youden指數(shù)。Sergerie等應(yīng)用TUNEL檢測不育患者和正常生育男性精子DNA完整性，同樣得出20%的診斷閾值。而在一個大樣本多中心的前瞻性研究也得到類似結(jié)論，認(rèn)為18%為SCD試驗預(yù)測體外受精技術(shù)受精率的截斷點。

本研究男性不育精子DNA完整性診斷閾值的確立，為臨床診斷、治療提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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