脂肪酶工程菌構(gòu)建、表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

王景樂(lè)

摘要：脂肪酶屬于絲氨酸水解酶，可以在油水界面把甘油三酯水解成甘油及脂肪酸，對(duì)于脂合成、脂水解、脂交換等眾多反應(yīng)具有重要的催化作用。因而，脂肪酶不僅在生物體的代謝中起重要作用，脂肪酶廣泛存在于植物、動(dòng)物以及微生物中。但天然的脂肪酶通常具有產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差等諸多缺點(diǎn)，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，利用基因工程對(duì)于脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改造，提升其催化能力與反應(yīng)穩(wěn)定性，生產(chǎn)高產(chǎn)的脂肪酶工程菌，具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：脂肪酶工程菌;構(gòu)建;純化;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：0939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.09.028

0 引言

在許多生產(chǎn)領(lǐng)域中，催化劑都必不可少。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，脂肪酶作為一種生物催化劑擁有高度催化特異性，而且其對(duì)于原料的要求低，帶來(lái)的副反應(yīng)少，有助于提高產(chǎn)品的品質(zhì)。同時(shí)，利用脂肪酶作為催化劑還能起到減少產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物和能源消耗的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，脂肪酶的獲得主要是通過(guò)基因工程的方法，選擇合適的表達(dá)體系構(gòu)建脂肪酶工程菌，并對(duì)經(jīng)過(guò)改造后重組的脂肪酶進(jìn)行純化，提高其純度，同時(shí)研究其酶學(xué)性質(zhì)找到能對(duì)重組脂肪酶活性產(chǎn)生影響的關(guān)鍵因素，進(jìn)而生產(chǎn)出能滿足應(yīng)用需要的脂肪酶。

1 構(gòu)建與表達(dá)

目前可以作為外源性蛋白表達(dá)系統(tǒng)的包括酵母、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)菌以及昆蟲(chóng)細(xì)胞等。而脂肪酶作為一種活性蛋白質(zhì)，用于脂肪酶工程菌的構(gòu)建，脂肪酶基因的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)等。

1.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是外源性脂肪酶基因應(yīng)用最早的表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)具有繁殖快、使用范圍廣泛、產(chǎn)量高以及易純化等眾多優(yōu)點(diǎn)，主要包括非融合型與融合型2種表達(dá)載體。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，選擇合適的表達(dá)宿主菌是一個(gè)關(guān)鍵的因素，需要考慮不同宿主菌的獨(dú)特表達(dá)特點(diǎn)，以確定其是否合適。如大腸桿菌BL21，其是為添加T7噬菌體設(shè)計(jì)的，在T7噬菌體轉(zhuǎn)錄中可以通過(guò)合酶的作用，將細(xì)胞絕大部分的營(yíng)養(yǎng)用于表達(dá)外源脂肪酶基因。而表達(dá)載體也是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因時(shí)不可或缺的，表達(dá)載體通常涵蓋啟動(dòng)子、克隆位點(diǎn)、基因片段、轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽、終止子以及操縱子等。質(zhì)粒是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要的表達(dá)載體，pET系列是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用比較廣泛的載體。此外，外源基因結(jié)構(gòu)也是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的關(guān)鍵要素。大腸桿菌是原核細(xì)胞，可以直接表達(dá)原核基因;真核基因則需要結(jié)合大腸桿菌的喜好進(jìn)行基因片段優(yōu)化，去掉內(nèi)含子。關(guān)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)外源性脂肪酶基因的研究成果有很多，CALB是一種底物譜廣泛且催化活性高的脂肪酶。2006年首次在大腸桿菌周質(zhì)中成功表達(dá)。通過(guò)乳糖啟動(dòng)子的控制，CALB的酶活力可以保持在2U/mg，與不同的分子伴侶還可以達(dá)到CALB融合表達(dá)的效果，在質(zhì)粒pGr07中其最高的酶活力可以達(dá)到61U/mg。但作為一種原核生物，大腸桿菌不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工修飾能力以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在復(fù)雜的蛋白質(zhì)表達(dá)中效果有限，因而在脂肪酶工程菌的構(gòu)建，脂肪酶基因的表達(dá)存在一定的局限性[1]。

1.2畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

與大腸桿菌不同，酵母是一種最簡(jiǎn)單的真核生物，擁有大腸桿菌沒(méi)有的基因調(diào)控機(jī)制。最早被作為外源基因表達(dá)真核宿主菌的酵母是S.cerevisiae，但由于S.cerevisiae在表達(dá)重組蛋白的過(guò)程中出現(xiàn)表達(dá)質(zhì)粒易丟失、菌株不穩(wěn)定、分泌效率差等缺陷。因此，新的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，成為脂肪酶基因表達(dá)較為理想的系統(tǒng)。畢赤酵母具有生長(zhǎng)繁殖快、高密度發(fā)酵、易于培養(yǎng)以及便于基因工程操作等突出的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，畢赤酵母還可以正確翻譯，并加工修飾外源真核基因。畢赤酵母可以將甲醇當(dāng)作唯一碳源，在單細(xì)胞蛋白表達(dá)生產(chǎn)中是極具價(jià)值的有用菌株。較早在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究中取得突破的是飛利浦石油公司與SIBIA。畢赤酵母表達(dá)宿主菌也也有多種，如GS115、X-33、MP-36、KM71等。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體方面，其啟動(dòng)子有誘導(dǎo)性的FLDI、LCL1、AOX1、YPTI以及組成型的GAP等，而pAOXl是最為常用的啟動(dòng)子。

2純化

純化是將發(fā)酵液中的生物雜質(zhì)去除，提高純度，以避免這些生物雜質(zhì)對(duì)于酶促反應(yīng)產(chǎn)生不利影響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。同時(shí)，脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的研究也要用到純酶，以便獲得更具有可靠性的數(shù)據(jù)，將其他干擾因素排除。

目前，蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)已經(jīng)得到突破性的發(fā)展，為脂肪酶的純化提供了必要的技術(shù)支持。天然蛋白的分離純化會(huì)經(jīng)過(guò)4個(gè)甚至更多的步驟獲得純度較高的酶。常規(guī)的方法有離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、硫酸銨分級(jí)沉淀、反膠束溶劑提取等。分離中，步驟越多則表示酶的收率越低，成本也越高。對(duì)于脂肪酶的分離純化，傳統(tǒng)的方法步驟復(fù)雜且成本高，而基因工程技術(shù)的發(fā)展為脂肪酶純化提供了廣闊的空間。通過(guò)在畢赤酵母、大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中的異源表達(dá)后，不僅提高了脂肪酶的產(chǎn)量，而且進(jìn)一步分離純化也更加有利。在構(gòu)建與表達(dá)中，可以通過(guò)在酶蛋白的N端、C端添加標(biāo)簽，就可以借助與添加的標(biāo)簽減少純化步驟，進(jìn)而提升純化效率。在分離純化中，可以通過(guò)組氨酸標(biāo)簽，采用鎳離子親和層析對(duì)脂肪酶進(jìn)行分離純化。分離純化過(guò)程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵的步驟：一是對(duì)于發(fā)酵上清液進(jìn)行微濾除雜;二是將經(jīng)過(guò)微濾的濾過(guò)液利用酶膜反應(yīng)器進(jìn)行超濾濃縮;三是進(jìn)行Ni柱親和層析;四是通過(guò)透析袋進(jìn)行脂肪酶液的透析;五是將分離純化的酶液進(jìn)行冷凍干燥，以便應(yīng)用于酶學(xué)性質(zhì)的分析中[2]。

3酶學(xué)性質(zhì)

了解脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)是將其研制成生物催化劑應(yīng)用于食品工業(yè)、生物制藥、洗滌行業(yè)、生物能源、飼料工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)。脂肪酶的種類多種多樣，不同類型的脂肪酶所具有的酶學(xué)性質(zhì)存在很大的差別，因而通過(guò)基因工程技術(shù)制備FJ重組脂肪酶必須進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。通常脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)主要體現(xiàn)在其受到溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等的影響上。

3.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

溶液的pH值是對(duì)大多數(shù)酶的活性產(chǎn)生影響的重要因素，包括脂肪酶。脂肪酶在某一個(gè)pH值下，酶的活力達(dá)到最大則是其最適pH。當(dāng)溶液的pH值偏離脂肪酶的最適pH越遠(yuǎn)，其酶的活性就會(huì)越小，無(wú)論是過(guò)酸還是過(guò)堿都會(huì)導(dǎo)致脂肪酶完全失活。重組脂肪酶最適pH及pH穩(wěn)定性的研究通常需要配置pH值不同的緩沖液，將純酶添加到不同的緩沖體系中，測(cè)定其水解活力，最終得到最適pH及pH穩(wěn)定性特征。

3.2最適溫度

在生產(chǎn)中，溫度會(huì)對(duì)脂肪酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生影響。掌握在不同的溫度下脂肪酶的活性及熱穩(wěn)定性，才能制備出滿足不同溫度條件下生產(chǎn)需要的脂肪酶生物催化劑。通常溫度對(duì)于脂肪酶的影響是多方面的，在低溫條件下，脂肪酶的活力比較弱，隨著溫度上升脂肪酶的活性會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的提升。而當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度值后脂肪酶的活性會(huì)逐步下降，并最終由于蛋白構(gòu)象出現(xiàn)熱變性而使脂肪酶徹底失活。最適溫度反映的是脂肪酶酶促反應(yīng)速度最大、活性最高的溫度。

3.3金屬離子對(duì)活性的影響

金屬離子濃度不同，脂肪酶的活性也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化。低濃度時(shí)，大部分的金屬離子對(duì)于脂肪酶都具有促進(jìn)作用，酶活性保持在一個(gè)較高的水平;而金屬離子的濃度過(guò)高，則會(huì)對(duì)脂肪酶的活性造成抑制，使其活性下降。對(duì)重組脂肪酶活性產(chǎn)生重要影響的金屬離子主要有C a2+、Ni2+、C02_、Li+、Mg2+、Mn2+，B a2+等。可以根據(jù)其性質(zhì)，在保證不影響反應(yīng)需求的基礎(chǔ)上，添加可增加脂肪酶活性的金屬離子，達(dá)到提高反應(yīng)效率的目的[3]。

4結(jié)束語(yǔ)

在脂肪酶工程菌的構(gòu)建與表達(dá)中，全面掌握大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，了解脂肪酶制備過(guò)程中分離純化的前沿技術(shù)，并正確把握脂肪酶工程菌的最適pH、最適溫度、不同濃度的金屬離子的影響等酶學(xué)性質(zhì)的研究手段，對(duì)于脂肪酶生物催化劑的生產(chǎn)及其在社會(huì)各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1]朱婧.稻米脂肪酶基因工程菌的構(gòu)建及性質(zhì)研究[D].長(zhǎng)沙長(zhǎng)沙理工大學(xué)，2014

[2]朱婧，謝定，文李.展示在畢赤酵母表面稻米脂肪酶的性質(zhì)研究[J].食品與機(jī)械，2014（3）：13-15.

[3]劉松脫氧核糖醛縮酶的基因工程菌構(gòu)建與表達(dá)及初步應(yīng)用 研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2014