20%大蒜素·丁香酚水乳劑的制備及生物活性

邵 晨，趙龍冬，孫立杰，孫 杰，王苗苗，張保華

（青島農業大學新農藥創制研究所，山東青島 266109）

隨著社會對環境的日益重視，乳油、粉劑等傳統農藥劑型的環境污染問題備受關注，水乳劑（EW）作為一種不用或很少用有機溶劑的水性化制劑，具有綠色、環保、安全的優點，已經成為代替傳統劑型產品尤其是乳油產品的主要環保劑型[1-3]。

植物源農藥是目前一類重要的生物農藥，主要是利用植物的次生代謝產物對農業病蟲草害進行防治[4-5]。大蒜素是從大蒜的球形鱗莖中提取的一種具有揮發性的黃色油狀物，主要成分是二烯丙基硫代亞磺酸酯。已有研究表明大蒜素對多種細菌、真菌和病毒有良好的抑制效果[6-8]。丁香酚是一種來源于丁香等植物的具有丁香香氣的酚類化合物，具有抑菌、抗病毒、保鮮和增強植物抗凍性等作用[9-12]。目前，大蒜素和丁香酚均被廣泛應用于醫藥、食品和農業領域。

基于大蒜素與丁香酚的環境友好性和廣泛抑菌活性，本研究以大蒜素和丁香酚作為有效成分，結合水乳劑的配方優化，確定了20%大蒜素·丁香酚水乳劑的穩定配方，并以灰葡萄孢菌為供試菌株測定其室內生物活性，以期為20%大蒜素·丁香酚水乳劑的進一步開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

原藥與制劑：大蒜素（98.5%），深圳市鼎誠植物香料有限公司；丁香酚（化學純），國藥集團化學試劑有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯乳油，巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司。助劑：主要有苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚（乳化劑33#），邢臺鑫藍星科技有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚（By-125），上海忠誠精細化工有限公司；聚醚磷酸酯類表面活性劑WJ-630、WJ-990，上海萬金助劑有限公司。結構調整劑：氯化鈉、尿素、硅酸鎂鋁、聚乙二醇400、聚乙二醇600。防凍劑：乙二醇、丙三醇、1,2-丙二醇。供試病原菌：灰葡萄孢菌。

BME型密閉式實驗室乳化剪切機，上海德雨機電設備有限公司；JA5003N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；BT-9300H型激光粒度分布儀，丹東百特儀器分析公司；三門電冰箱，青島海爾股份有限公司；101型電熱鼓風干燥箱，龍口市先科儀器有限公司；紫外分光光度檢測儀，北京普析通用儀器有限責任公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫培養箱，寧波江南儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 20%大蒜素·丁香酚水乳劑的制備

采用轉相法制備20%大蒜素·丁香酚水乳劑。稱取一定量的大蒜素與丁香酚，加入一定量乳化劑后，混合攪拌形成油相，將結構調整劑、防凍劑等助劑與蒸餾水混合形成水相。在高速剪切的過程中，將水相加入到油相中，充分混合，在3 500 r/min的剪切速度下剪切5 min，自發形成油包水型體系。

1.2.2 指標測定方法

按照《農藥熱貯穩定性測定方法》（GB/T 19136—2003）測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑在（54±2）℃條件下貯存7 d的穩定性。按照《農藥低溫穩定性測定方法》（GB/T 19137—2003）測定冷貯穩定性。按照《農藥乳液穩定性測定方法》（GB/T 1603—2001）測定乳液穩定性。

1.2.3 粒徑測定方法

20%大蒜素·丁香酚水乳劑的粒徑利用激光粒度分布儀測定，平行測定3次后取其平均值。

1.2.4 有效成分含量測定方法

參考文獻[13]的方法，將20%大蒜素·丁香酚水乳劑、大蒜素標準品、丁香酚標準品分別用無水乙醇溶解稀釋，用紫外分光光度計在200～400 nm對大蒜素、丁香酚的標準品進行光譜掃描，得到兩種有效成分的最大吸收波長。在其最大吸收波長下，分別測定不同稀釋濃度的大蒜素、丁香酚的吸光度，得到大蒜素、丁香酚的標準曲線：y=0.139 6 x＋0.364（R2=0.9937）；y=0.0197x＋0.0263（R2=0.9928）。分別在兩個吸收波長下，測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的吸光度，計算制劑中有效成分大蒜素、丁香酚的含量。

1.2.5 生物活性測定方法

以灰葡萄孢菌為供試菌，采用生長速率法測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑對供試菌株的室內生物活性。

2 結果與分析

2.1 乳化劑的篩選

2.1.1 單一乳化劑的篩選結果

水乳劑中的乳化劑可使油水的界面張力和表面自由能降低，而且乳化劑具有空間位阻作用和靜電作用，促使乳液體系更加穩定[14]。5種單一乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑各項性能的影響見表1。乳化劑加入量為5%。

表1 5種單一乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑各項性能的影響

結果顯示，在5種備選乳化劑中，WJ-630、WJ-990各項性能相對較好，常溫放置一段時間無油滴析出，熱貯有少量析水分層。這兩種乳化劑的D10值、D50值和D90值較小（圖1）。因此，選擇WJ-630、WJ-990兩種乳化劑用于復配乳化劑的篩選優化。

圖1 5種乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑粒徑的影響

2.1.2 復配乳化劑的篩選結果

不同的乳化劑具有不同的親水親油特性，通過乳化劑復配可以實現乳化劑的協同作用，提高水乳劑的各項性能和制劑的穩定性。結合以上對單一乳化劑的篩選結果，將WJ-630、WJ-990兩種乳化劑按不同質量比例復配，總用量為5%。結果見表2和圖2。

結果顯示，兩種乳化劑復配后對水乳劑體系的穩定性均有影響。在不同復配比例中，當WJ-630和WJ-990的質量比為4∶1時，水乳劑各項性能指標較好，具有較小的粒徑和粒度范圍。但此配方長時間貯存后仍有微量水析出，需要加入結構調整劑改善水乳劑的穩定性。

表2 乳化劑質量比的篩選

圖2 乳化劑的不同質量比對水乳劑粒徑的影響

2.2 結構調整劑的篩選

結構調整劑可以通過調節體系黏度、多相的密度差等方式，降低分散相微粒的沉降聚結速度，提高水乳劑體系的穩定性。在對乳化劑篩選的基礎上，選擇幾種結構調整劑進一步改善水乳劑的各項性能，結果見表3和圖3。結構調整劑加入量為3%。

表3 結構調整劑的篩選結果

圖3 結構調整劑對水乳劑粒徑的影響

結果顯示，不同結構調整劑對水乳劑的外觀影響不大，均能達到合格，但乳液穩定性存在差異。綜合各項性能測定結果，加入聚乙二醇400的水乳劑體系具有良好的穩定性，且其能夠使水乳劑體系保持較小的粒徑和較窄的粒度范圍。因此，選擇聚乙二醇400作為水乳劑的結構調整劑。

2.3 防凍劑的篩選結果

水乳劑作為一種油水分散體系，在低溫條件下易冷凍結冰，防凍劑的加入可以保障其在低溫下依然保持良好的流動性，使水乳劑在低溫時保持良好穩定性。經過對4種防凍劑的篩選，發現加入3%乙二醇時，水乳劑乳液穩定性、分散性等性能表現良好。

2.4 配方的確定及性能測定

經過篩選，確定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的優化配方為：大蒜素5%、丁香酚15%、WJ-630 4%、WJ-990 1%、聚乙二醇400 3%、乙二醇3%，用去離子水補足至100%。所制水乳劑產品指標檢測結果見表4，均達到產品標準要求。

表4 20%大蒜素·丁香酚水乳劑指標檢測結果

2.5 生物活性測定結果

以灰葡萄孢菌作為供試菌，25%吡唑醚菌酯乳油作為對照藥劑，測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的室內抑菌活性。通過表5可以看出，20%大蒜素·丁香酚水乳劑在所有稀釋倍數下對灰葡萄孢菌均有較好的抑菌效果，其500倍稀釋液與25%吡唑醚菌酯乳油1 500倍稀釋液的抑菌效果相當。

表5 20%大蒜素·丁香酚水乳劑對灰葡萄孢菌的抑菌率（72h）

3 結論和討論

通過對乳化劑、結構調整劑、防凍劑及其配比的篩選和優化，確定了20%大蒜素·丁香酚水乳劑的最終配方為：大蒜素5%、丁香酚15%、復配乳化劑WJ-630 4%、WJ-990 1%、結構調整劑聚乙二醇400 3%、防凍劑乙二醇3%，去離子水補足至100%，所制備的水乳劑各項指標均達到產品標準。室內生物活性測定結果表明，20%大蒜素·丁香酚水乳劑在稀釋500倍時，對灰葡萄孢菌的抑制率為92.41%，與25%吡唑醚菌酯乳油1 500倍稀釋液的抑菌效果相當。

丁香酚和大蒜素均是從植物中提取的天然活性成分，具有良好的環境相容性，將其作為原藥制成水基化制劑水乳劑在病蟲害綠色防控中具有環保優勢。但由于二者存在易氧化、水解等不穩定性[15-16]，限制了其水基化制劑的開發和應用推廣。本研究通過系統篩選水乳劑的助劑得到了穩定配方，能夠為大蒜素和丁香酚相關制劑產品的研究提供參考。