清熱解毒法對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤轉移的影響*

周華妙 郭 勇

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

乳腺癌是嚴重威脅全球女性健康的疾病之一，我國女性乳腺癌發病人數約24.9萬,發病率37.86/10萬，在近10年發病呈上升趨勢[1]，但乳腺癌的總體生存狀況明顯好于其他常見惡性腫瘤，我國女性乳腺癌患者的5年生存率估計為73%，條件較好的大城市可達80%，而影響其死亡的仍然是復發轉移。乳腺癌在中醫學中多屬于“乳巖”“乳石癰”，由于情志失調，肝氣郁結或因沖任失調，氣血運行不暢，氣滯血瘀，熱毒結滯于乳中而發病。而清熱解毒法是中醫治療腫瘤的常用治法之一，并在長期的臨床治療中獲得了一定的療效[2]，但是其作用機制報道不多。本次實驗中建立乳腺癌4T1細胞荷瘤小鼠模型，選用黃連解毒湯進行干預，觀察其對乳腺癌4T1細胞荷瘤小鼠腫瘤細胞侵襲遷移能力，探尋對腫瘤相關巨噬細胞的影響及一些可能的相關機理。

1 材料與方法

1.1 動物：8周齡Balb/c小鼠，體重為18±2g，SPF級飼養；浙江中醫藥大學動物實驗中心喂養（實驗動物編號：0238458；0238459）。

1.2 細胞株：小鼠乳腺癌4T1細胞株由浙江中醫藥大學動物實驗中心細胞房提供。

1.3 主要試劑與儀器：黃連解毒湯由浙江省中醫院中藥房熬制并于浙江中醫藥大學制劑中心濃煎后滅菌封裝備用。灌胃工具由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。基質膠（BD-P 253234），Transwe11小室（Corning），PBS（1×）（凱基），DMEM高糖培養基（1×）（吉諾），1640培養基（1×）（含雙抗）（凱基），胎牛血清（四季青），0.25%胰酶-EDTA（吉諾），BSA(MULTICELL)，結晶紫（達文），移液槍（eppendorf），離心機（Thermo），熒光倒置顯微鏡（Zeiss），高壓滅菌箱（SANYO）等。

1.4 試驗方法與步驟：將20只8周齡雌性Balb/c小鼠按隨機數字表法隨機分為2組，每組10只，即單純荷瘤組、清熱解毒組。于單純荷瘤組、清熱解毒組小鼠乳腺脂肪墊接種小鼠乳腺癌4T1細胞，接種后24h給藥：單純荷瘤組：以飲用水灌胃，每日0.2ml/10g；清熱解毒組：以黃連解毒湯灌胃，每日0.2ml/10g。持續用藥35天，黃連解毒湯組成：黃芩、梔子各9g，黃連、黃柏各6g。湯劑由浙江省中醫院中藥房熬制并于浙江中醫藥大學制劑中心濃煎后滅菌封裝備用。

1.5 瘤體及其他組織標本：第35天于超凈臺解剖各組小鼠，以無菌眼科剪、手術刀片打開小鼠胸腔、腹腔并開顱，行大體觀察，剝離出瘤體，做記錄，稱重，拍照。對瘤體處理：①進行Tanswell侵襲及遷移實驗；②進行流式細胞分析；③取出小鼠右側肺臟于電子天平中稱重，脫水、包埋，常規石蠟切片，進行HE染色計數右肺轉移結節灶。

1.6 Transwell侵襲實驗：①Transwell小室制備：用50mg/L基質膠1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。吸出培養板中殘余液體，每孔加入50μl含10g/L BSA的無血清培養液，37℃，30min。②制備細胞懸液：小鼠乳腺原位接種后24d，行頸椎脫臼法處死，選擇單純荷瘤組、清熱解毒組乳腺原位瘤體組織，取出后采用組織塊接種法移植回培養瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培養基行體外培養，3天后移去小瘤塊，換液后繼續培養以擴大細胞總量。將瓶中處于對數生長期的細胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，調整細胞密度至1×105～5×105。③接種培養細胞：細胞懸液（100～200μl）加入Transwell小室，常規培養24小時。④結果統計：用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，采用0.1%結晶紫進行細胞染色，顯微鏡進行觀察和拍照，取10個視野計數細胞個數。

1.7 Transwell遷移實驗：①Transwell小室每孔加入50μl含10g/L BSA的無血清培養液，37℃，30min。②制備細胞懸液：小鼠乳腺原位接種后24d，行頸椎脫臼法處死，選擇單純荷瘤組、清熱解毒組乳腺原位瘤體組織，取出后采用組織塊接種法移植回培養瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培養基行體外培養，3天后移去小瘤塊，換液后繼續培養以擴大細胞總量。將瓶中處于對數生長期的細胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，調整細胞密度至1×105～5×105。③接種培養細胞：細胞懸液（100～200μl）加入Transwell小室，常規培養24小時。④用棉簽擦去上室內的細胞，采用0.1%結晶紫進行細胞染色，顯微鏡進行觀察和拍照，取10個視野統計細胞遷移面積，并計算遷移面積百分比。取平均數作為遷移面積百分比結果，進行整理及統計分析。

1.8 流式細胞分析術：將新鮮腫瘤提取巨噬細胞，上機檢測，使用BD FACSCantoⅡ進行流式細胞計數分析，根據抗體與檢測通道“強弱搭配”原則，抗體F4/80使用FITC通道，CD206使用APC通道，iNOS使用PE通道，先用單抗體染色樣本選定陽性區域，以FITC、PE通道雙陽性表示M1型巨噬細胞，以FITC、APC通道雙陽性表示M2型巨噬細胞進行細胞計數，分別計算其在樣本細胞中的陽性率，并將陽性率結果進行整理及統計分析。

1.9 統計學分析：采用SPSS 17.0統計軟件分析處理。統計描述：計量資料數據用均數±標準差(-x±s)表示。統計推斷：兩組間均數的比較用t檢驗分析，均以P＜0.05為差異顯著的檢驗標準。

2 結果

2.1 HE染色觀察肺臟轉移情況：見圖1。兩組小鼠肺組織表面凹凸不平，可見散在透亮的類圓形結節灶。肺組織HE染色，各組小鼠肺組織中均可見明顯的團狀腫瘤細胞生長，伴有大量異形核細胞增生，大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤。低倍鏡（100×）下觀察并隨機取4個視野計數小鼠右肺轉移灶。結果顯示，單純荷瘤組3.5±1.29個小鼠肺部轉移灶，清熱解毒組2.7±0.96個，與單純荷瘤組相比較少，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 小鼠肺部轉移灶HE染色

2.2 Transwell侵襲及遷移實驗觀察腫瘤細胞轉移能力：見圖2、圖3。侵襲實驗結果：清熱解毒組穿透Transwell膜的細胞數量268.4±11.23，比單純荷瘤組（285.7±13.55）有所減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；遷移實驗結果：清熱解毒組遷移面積百分比（66.76±7.46）%與單純荷瘤組（72.3±2.83）%相比有所減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 Transwell侵襲實驗

圖3 Transwell遷移實驗

2.3 流式細胞術檢測小鼠腫瘤相關巨噬細胞：見圖4。抗體F4/80使用FITC通道，iNOS使用PE通道，CD206使用APC通道，以F4/80(+)iNOS(+)代表M1型巨噬細胞，F4/80(+)CD206(+)代表M2型巨噬細胞。結果如下：M1型巨噬細胞：單純荷瘤組中M1型巨噬細胞含量較低（1.8±0.10）%，清熱解毒組中M1型巨噬細胞含量（2.3±0.20）%與單純荷瘤組相比較多，差異有統計學意義（P＜0.05）；M2型巨噬細胞：清熱解毒組中M2型巨噬細胞含量較高（36.3±3.70）%，與單純荷瘤組（21.5±1.50）%相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 流式細胞分析

3 討論

腫瘤轉移是一系列復雜的、多步驟、多因素相互作用的連續過程，由原發瘤發展成為侵襲性腫瘤，腫瘤細胞侵襲基底膜，并進入淋巴系統與血液循環，形成瘤栓，進入并穿出靶器官微血管，形成轉移灶[3]。本實驗采用經典的黃連解毒湯干預荷瘤小鼠，該方具有抗菌、抗內毒素、解熱鎮痛、抗腫瘤作用等諸多藥理作用[4]，可明顯抑制腫瘤細胞的增殖能力以及誘導腫瘤細胞凋亡[5]。其有效成分漢黃芩素可明顯抑制腫瘤細胞分裂和集落形成能力，從而抑制其增殖，同時，可通過啟動線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡[6]。在腫瘤組織中，TAMs通常被定向極化為具有免疫抑制作用的M2型巨噬細胞，直接抑制細胞毒性T淋巴細胞（CTL細胞）和自然殺傷細胞（NK細胞）對腫瘤的殺傷作用[7-10]。研究發現[11]，荷瘤小鼠經黃連解毒湯干預后，腫瘤組織新生微血管數目減少，故其控制腫瘤細胞轉移的作用可能與抗腫瘤血管生成有關。

中醫學認為，腫瘤其證多屬本虛標實，而“女子乳頭屬肝，乳房屬胃”，若肝失疏泄，氣機郁滯，或脾胃運化失司，濕熱蘊結，則易乳絡閉阻，氣血熱毒瘀滯，發生病變。黃連解毒湯以清熱解毒為法，清解蘊結之熱毒，化邪去毒，是治療乳腺癌的主要治法之一。本實驗中觀察到黃連解毒湯干預后，荷瘤小鼠腫瘤細胞的侵襲遷移能力產生了一定的抑制，筆者推測通過清熱解毒減弱了腫瘤細胞的侵襲遷移，另外，荷瘤小鼠的肺轉移灶有減少趨勢，而流式細胞檢測發現腫瘤相關巨噬細胞M1型、M2型均有增加，故推測黃連解毒湯一定程度抑制腫瘤侵襲遷移，從而達到控制腫瘤的遠處轉移，可能并非主要通過調節腫瘤相關巨噬細胞中M1以改善免疫微環境來抑制腫瘤發展，這與中醫理論中清熱解毒以祛邪為主相統一。但因考慮到小鼠辨證論治的困難度，因此在實驗中未進行辨證論治，存在一定的局限性，以及進一步的可能機制有待繼續探討和研究。