紫娟綠茶化學成分與抗氧化活性相關性研究

劉倩葶，念波，石興云，焦文文，蔣賓，張正艷，周玲霞，馬燕，陳立佼，蔣勛，王興華，趙明,2,3*

1.云南農業大學龍潤普洱茶學院，650201；2.云南農業大學云南省藥用植物生物學重點實驗室，650201；3.云南農業大學西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，650201；4.普洱市茶葉科學研究所，665000；5.普洱茶樹良種場，665000

茶樹新梢一般為黃綠色，但在群體品種茶園中，容易發生紅紫化葉色突變。目前中國[1-2]、日本[3]、肯尼亞[4-7]和印度[8]等國家都有發現新梢紫化或紅化的栽培品種，如“紫娟”[9]和“Sunrouge tea”等品種。其中，由云南省農業科學院茶葉研究所培育而成的新梢呈紫色的品種“紫娟”，是茶樹葉色紅紫化突變的典型代表之一，所制烘青綠茶的干茶和茶湯均為紫色，已經成為我國一個重要的特種茶樹良種[10]。

花青素是茶葉中多酚類化合物之一，在茶葉中的含量為0.01%左右[11]。研究發現，茶樹葉色紅紫色突變的主要原因是其富含花青素或花色苷成分。例如，蕭力爭等[12]研究發現花青素含量與紅紫色突變芽葉的紫色深淺程度密切相關，芽葉紫色程度越深，花青素含量越高。此外，梁名志[13]、楊興榮[14]、費旭元[15]、王秋萍[16]、許燕[17]等都對“紫娟”茶中的花青素含量進行了研究。盡管上述各研究在測定的花青素或花色苷含量與組成方面略有不同，但研究結果基本揭示了紫娟茶中的花青素含量要高于一般黃綠色茶葉，其一芽二葉花青素含量可高達29.14 mg/g[14]。此外，王帥[18]、費旭元[15]、李燕麗[19]、龔加順[20]和Jiang[21]等研究分析了紫娟茶中的花色苷組成，目前已經鑒定出了飛燕草-3-半乳糖苷 （Delphinidin 3-O-β-D-galactoside chloride）、矢車菊-3-半乳糖苷（Cyanidin 3-O-galactoside chloride）、天竺葵色素-3,5-二葡萄糖苷（Pelargonidin 3,5-diglucoside）等花色苷成分。

富含花青素的紫娟茶具有很大的開發價值。紫娟中既含有兒茶素、茶氨酸、咖啡堿等茶葉中常見的生物活性成分，同時也富含具有多種生理功能的花青素成分，這為其具有的保健功能奠定了重要的化學物質基礎。國內外學者研究發現，紫娟茶具有多種保健功能，例如抗炎和抗腫瘤[22]、降壓[23-24]、抑菌[25]、預防炎癥[26]及治療阿爾茲海默癥[27]等。此外，戴妙妙等[28-29]研究發現，同等濃度條件下，紫娟茶花色苷對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的捕獲能力高于BHA和BHT，清除ABTS+陽離子自由基的能力高于BHT，低于BHA。

抗氧化物質可以清除呼吸（氧化反應）、外界污染、放射線照射等因素產生的自由基[30]。花青素和兒茶素等被認為是紫娟茶中重要的抗氧化活性物質。不同紫娟茶類中紫娟綠茶抗氧化活性最強[31]。初步研究表明，其總抗氧化活性與其茶多酚和兒茶素含量呈顯著的正相關，其清除DPPH自由基活性與其花青素含量呈顯著正相關[32]。

為此，本文以同一批紫娟鮮葉為原料，分別加工成烘青、炒青、曬青和蒸青4種類型的綠茶，分別測定茶樣中的花青素、黃酮類和兒茶素等物質，并分析生化成分含量與抗氧化活性之間的相關性，以期為進一步探究紫娟茶中抗氧化活性物質等提供科學依據。

一、材料與方法

1.材料、主要儀器以及主要試劑

（1）茶葉加工

紫娟茶樹鮮葉采自云南省普洱市普洱茶樹良種場，采摘標準為一芽二葉，按照圖1所示方法，分別加工成烘青、炒青、曬青、蒸青4種綠茶。

（2）主要試劑

DPPH（HPLC級，上海源葉生物科技有限公司）、總抗氧化（T-AOC）和羥自由基試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

飛燕草色素（Dp）、矢車菊色素（Cy）、牽牛花色素（Pt）、天竺葵色素（Pg）、芍藥色素（Pn）、錦葵色素（Mv）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、鞣花酸（EA）、沒食子酸（GA）、1,4,6-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖（GG）、咖啡堿（CA）和黃酮類化合物木犀草素（Lu）、楊梅素（My）、槲皮素（Qu）、山奈酚（Kf）均購自成都曼思特生物科技有限公司。準確稱取計算量的各單體對照品10.00 mg，用甲醇充分溶解并定容至10 mL，搖勻后得到1.00 mg/mL的各單體儲備液，放于-80℃冰箱保存，用時根據需要混合或用甲醇進行稀釋。

（3）主要儀器

1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、SHZ-DIII予華牌循環式真空泵（上海市崇明實驗儀器廠）、X-5紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）、Smart-Q30試驗超純水器（上海和泰儀器有限公司）、6CST-30滾筒殺青機（浙江上洋機械有限公司）、6CR-30茶葉揉捻機（浙江上洋機械有限公司）、6CZ全自動蒸茶機（云南省包裝食品機械廠）、BS-CG茶葉電炒鍋（山東秉盛重工機械有限公司）、ATH-206B茶葉烘焙機（福建佳友機械有限公司）。

2.試驗方法

（1）化學成分測定

圖1 4種紫娟綠茶的加工方法

參照《茶 水浸出物測定》（GB/T 8305—2013）[33]測定水浸出物（WE）含量；使用茚三酮比色法[34]、酒石酸亞鐵比色法[35]和硫酸蒽酮比色法[36]測定游離氨基酸（AA）總量、茶多酚（TP）和可溶性糖（SS）含量；使用高效液相色譜法（HPLC） 測定茶葉花青素 （Dp、Cy、Pt、Pg、Pn、Mv）的含量[37]；HPLC方法測定兒茶素（C、EC、EGC、ECG、EGCG）、GA、GG 和 CA[38]、EA、黃酮類化合物（Lu、Kf、My、Qu）含量[39]。

（2）抗氧化活性測定

紫娟茶樣液制備：精密稱取磨碎茶樣1.00 g，加45 mL沸蒸餾水，移入沸水浴浸提45 min（每隔10 min搖1次），趁熱過濾至50 mL容量瓶，濾渣用少量沸水沖洗數次，冷卻后定容，所得茶汁稀釋至適合濃度，供待測用。

精密吸取2 mL已經配置好的0.04 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇于試管中，充分搖勻后避光反應15 min，用無水乙醇作為空白對照，在波長517 nm處測定吸光值，記為A0；用樣品稀釋液代替無水乙醇，其余操作同上，測得吸光值記為A1；用樣品稀釋液代替DPPH無水乙醇溶液，其余操作同上，測得吸光值記為A2。

清除DPPH自由基能力的測定[40]：取適量樣液稀釋1 000倍后測定。按如下公式計算樣品對DPPH自由基的清除率：

清除羥自由基（·OH）活性的測定：取適量樣液稀釋40倍，使用羥自由基清除能力試劑盒測定其對羥自由基的清除率（具體操作及計算遵循試劑盒內說明書）。

測定清除超氧陰離子（·O2-）能力：取適量樣液稀釋4倍后測定，采用鄰苯三酚自氧化法[41]。

總抗氧化活性的測定：取適量上述樣液稀釋13倍，使用總抗氧能力（T-AOC）試劑盒測定其總抗氧化能力（具體操作及計算遵循試劑盒內說明書）。

（3）數據分析

所有的統計分析和數據處理應用軟件SPSS 22、TBtools JRE.1.6、Cytoscape和Origin8.0進行，每個處理重復3次，每個測定重復2次，以平均值±標準差（mean±SD）表示。

二、結果與分析

1.4種類型的紫娟綠茶主要化學成分比較

紫娟綠茶的化學成分測定結果如表1所示。可見，4種類型綠茶中的水浸出物含量為36.65%～53.28%，其中曬青綠茶的水浸出物顯著高于炒青綠茶和烘青綠茶（P＜0.05）。茶多酚是茶葉生物活性的主要成分，也是衡量茶葉及制品質量的重要指標[42]，4種類型的紫娟綠茶均含有豐富的茶多酚，含量范圍介于22.74%～40.15%，蒸青綠茶的茶多酚含量顯著高于炒青和烘青綠茶（P＜0.05）；可溶性糖和游離氨基酸含量平均值分別為6.11%和3.30%。

4種類型綠茶中均檢測到6種花青素單體（表1），單體含量趨勢為Dp＞Cy＞Pg＞Pt＞Mv＞Pn，其中Cy、Pt在炒青綠茶中含量最高，在曬青綠茶中最低。花青素總量范圍為2.79～3.45 mg/g，各茶類之間差異不顯著（P＞0.05）。

4種類型綠茶中兒茶素總含量介于161.72～191.59 mg/g之間，EGCG是含量最高的兒茶素單體，其含量介于64.91～75.39 mg/g之間。蒸青綠茶中的EC、ECG、EGC和EGCG的含量均高于曬青、炒青、烘青綠茶。

蒸青綠茶中CA、GG、EA和My含量均顯著高于曬青綠茶（P＜0.05）；Lu在炒青綠茶中最低，蒸青中最高；Kf在烘青綠茶中含量最高，炒青綠茶中最低；在4種類型綠茶中GA、Qu的含量無顯著差異（P＞0.05）。總體來說，同一紫娟鮮葉原料加工的蒸青綠茶中的茶多酚、可溶性糖、咖啡堿、EA、EC、ECG、EGC和EGCG含量水平一般均高于其他3種類型的綠茶產品。

表1 4種類型紫娟茶樣品生化成分含量

2.抗氧化能力的比較分析

4種類型紫娟綠茶表現出不同的抗氧化能力（圖2）。結果表明，DPPH自由基的清除率范圍是47.40%～94.58%，蒸青綠茶的清除率顯著高于曬青、炒青和烘青綠茶（P＜0.05）；4種紫娟綠茶的羥自由基清除率范圍是54.16%～57.16%，無顯著差異（P＞0.05）；超氧陰離子清除率范圍是32.84%～52.65%，烘青綠茶的清除率顯著高于曬青、炒青、蒸青綠茶（P＜0.05）；4種紫娟綠茶總抗氧化能力范圍是36.03～55.74 U/mg，蒸青綠茶總抗氧化能力顯著高于炒青和烘青綠茶（P＜0.05）。

3.4種類型紫娟綠茶化學成分和抗氧化活性的相關性分析

圖2 4種紫娟綠茶的抗氧化活性

對4種類型紫娟綠茶的茶多酚、花青素、黃酮類物質、可溶性糖和游離氨基酸等化學成分和茶湯清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基能力以及總抗氧化能力進行相關性分析，結果如表2。

表2 紫娟綠茶化學成分和抗氧化活性的相關性

從表2可知，Pn和Mv與總抗氧化能力負相關，茶多酚、可溶性糖與總抗氧化能力呈極顯著（P＜0.01）正相關，Mv與4項抗氧化活性指標均呈負相關，游離氨基酸、Pn與DPPH清除率負相關，水浸出物、游離氨基酸和茶多酚等與羥自由基清除率正相關，游離氨基酸與超氧陰離子清除率顯著正相關，而水浸出物、茶多酚與超氧陰離子清除能力呈極顯著負相關。

三、討論

紫娟品種從外形到內質都與其他大葉茶種有明顯的區別，鮮嫩梢為紫色，化學成分差異較大[43]。本研究表明，紫娟茶鮮葉加工成的蒸青綠茶中茶多酚和可溶性糖含量分別為40.15%和6.33%，明顯高于云南大葉種的30.00%～33.00%和1.0%～3.5%[44]，EGCG平均含量為70.30 mg/g。

王燕[45]、馮麗琴[46]等分別發現紫娟茶中花青素的濃度與其總抗氧化能力呈正相關、花青素含量與清除DPPH能力呈正相關；袁雪艷等[47]亦發現花青素濃度與抗氧化活性（清除DPPH、羥自由基和超氧自由基能力）呈線性相關。本研究中花青素除Mv和Pn外，Dp、Cy、Pt和Pg均與DPPH清除率呈正相關。閆征等[48]研究發現總酚、總黃酮等含量與抗氧化能力呈顯著相關，總多酚含量越高，清除DPPH自由基能力越強[49]，多酚和兒茶素單體對DPPH和羥自由基具有很強的清除作用[46]，紫娟茶茶多酚、兒茶素含量與總抗氧化能力均呈正相關[50]。蒸青綠茶多酚含量高于其他3種類型綠茶，測定發現紫芽蒸青綠茶總抗氧化能力也高于曬青、炒青和烘青綠茶。不同的是，研究發現茶多酚含量與超氧陰離子清除率呈負相關。該結果與李翠英等[51]、陳瑩[52]的研究報道類似，他們分別發現隨茶多酚濃度的增加，貯藏期杏果實的超氧陰離子產生速率增加[51]，膏狀或粉狀茶多酚的超氧陰離子清除能力隨添加量的增加而降低[52]。

四、結論

通過對4種類型紫娟綠茶的化學成分和體外抗氧化活性進行測定，結果表明，紫娟綠茶含有豐富的茶多酚、可溶性糖、花青素和兒茶素等化學成分；蒸青綠茶清除DPPH自由基和總抗氧化能力最強，烘青綠茶清除超氧陰離子能力最強。化學成分和抗氧化活性的相關性分析顯示，花青素中的Pt、Pg、黃酮類中My和Qu，以及可溶性糖和沒食子酸等與4項抗氧化活性均正相關，茶多酚與總抗氧化能力極顯著正相關，但與超氧陰離子清除率極顯著負相關。