細胞外囊泡的分離及鑒定方法

邊素艷?劉宏斌

【摘要】細胞外囊泡（EV）是細胞在靜息或應激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質雙層膜結構的囊泡總稱。根據(jù)EV的生成方式、大小或功能不同，可以分為外泌體、微囊泡和凋亡小體等不同亞群。EV的體積小、密度低、分離難度大，而且不同的分離方法得到的EV理化性質不同。目前對EV的認識尚不充分，鑒定方法也缺乏統(tǒng)一標準，是制約EV研究和應用轉化的最主要因素。該文就EV的分類、產生機制、特征以及EV的分離和鑒定方法進行綜述，為EV的研究提供參考。

【關鍵詞】細胞外囊泡;外泌體;微囊泡;分離;鑒定

細胞外囊泡（EV）是細胞在靜息或應激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質雙層膜結構的囊泡總稱，囊泡的直徑從數(shù)十納米至數(shù)微米。幾乎所有活細胞均可釋放EV，它們存在于各種生物流體中，如血液、唾液、尿液以及細胞外環(huán)境等。

越來越多的證據(jù)表明，EV中包含母細胞相關的蛋白質（如CD9、CD63、CD81、MHC-I等）、脂類、核苷酸[包括DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、環(huán)狀RNA（cirRNA）及其他非編碼RNA]和糖等多種生物活性物質，通過靶細胞內化、受體-配體間相互作用或脂質膜融合等方式，廣泛參與細胞之間的信息傳遞，對維持各種生理過程至關重要，如免疫監(jiān)視、凝血、干細胞維護、組織修復等。此外，有研究發(fā)現(xiàn)EV還參與傳染病和炎癥、神經系統(tǒng)疾病和癌癥等多種病理過程，可用于監(jiān)測疾病進展和治療反應等，同時由于它們具有遞送生物活性物質的功能，可開發(fā)成為新的藥物載體。這些EV的存在為多方位、多角度揭示疾病發(fā)生、發(fā)展機制提供了豐富的生物學信息，有望成為生物醫(yī)學研究和應用開發(fā)的技術平臺[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞（MSC）來源的EV具有與MSC相似的生物學效應，如減少細胞凋亡、減輕炎癥反應、促進血管生成、抑制纖維化、提高組織修復潛力等，而且易提取、改造，與干細胞移植相比致瘤風險低，在損傷修復的生物學治療中具有廣闊應用前景[2]。

鑒于EV具有重要生物學功能、廣闊的研究和應用前景，近年來對EV的研究呈指數(shù)性增長，作為一個新興領域受到學者的廣泛關注。然而，由于EV的體積非常小，對其分離、觀察和鑒定具有一定的挑戰(zhàn)性，尋找高效的EV分離和鑒定方法是研究的前提。本文就上述問題進行文獻綜述，為EV的研究提供一定的參考。

一、EV的分類、產生機制及特征

根據(jù)EV的生成方式、大小或功能不同，可以分為起源于內吞途徑的外泌體、質膜釋放的微囊泡和細胞凋亡產生的凋亡小體3種亞群[1]。

3種EV亞群的產生機制不同。外泌體起源于細胞的內涵體系統(tǒng)[2]。首先細胞膜內陷形成初級內涵體，內涵體膜再次內陷形成多個腔內小泡，此時包含多個腔內小泡的內涵體即次級內涵體也叫做多囊泡體。多囊泡體是真核細胞重要的蛋白運輸與分揀中心，當多囊泡體與胞膜融合后，其內的管腔狀囊泡凹陷，以內出芽方式形成直徑為30 ～ 120 nm顆粒狀小囊泡，并釋放入細胞外環(huán)境，即外泌體。微囊泡是細胞質膜直接以“出苞”的方式向細胞外突出形成的大囊泡，直徑為100 ～ 1000 nm。凋亡細胞的胞膜內陷，分割包裹核碎裂形成的染色質塊（核碎片）和胞質，然后通過出苞或起泡等方式，從細胞脫落形成一些大小不等的囊泡，即凋亡小體。此外，凋亡細胞內線粒體、內質網等細胞器和胞質成分被內質網膜包裹形成自噬體，與凋亡細胞膜融合后，排出體外也可形成凋亡小體，直徑800 ～ 5000 nm。這3種EV亞群的特征見表1。本文中EV主要指外泌體和微囊泡。

EV的組成成分并非隨機的，研究表明，細胞在不同的狀態(tài)分泌的EV內含物不同，每一個EV都會攜帶特定的分子信息，包裝的獨特分子構成決定了要傳遞給受體細胞的細胞外信號的類型，而且由一個復雜的分選系統(tǒng)來決定那些分子能夠進入細胞外囊泡[3]。4種不同的機制可用于描述這種“貨物”裝載方式：轉運需要的內涵體分選復合物（ESCRT）機器及相關蛋白質、大量脂質、高階聚化反應、通過神經酰胺分離成微區(qū)。

二、分離方法

EV的體積小、密度低，分離難度大，而且不同的分離方法得到的EV理化性質不同，這導致了EV研究存在大量不可控性和難重復性，是制約EV研究和應用轉化的最主要因素[4]。利用EV的物理和生物化學性質，已經開發(fā)了許多分離技術，如超速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法、基于微流控的分離技術等[5]。但是，在所有已知的方法中，還沒有同時滿足快速、簡便、高效及提取的EV形態(tài)、純度、產量和生物活性均符合后續(xù)實驗要求的方法。目前商品化的沉淀試劑盒提取外泌體速度快，產量高，但是價格較為昂貴，試劑殘留較多，有一定的細胞毒性，對后續(xù)的功能試驗影響較大。只有將現(xiàn)有的提取方法進行整合，才能有效降低樣本中的雜質[4]。目前普遍應用的提取外泌體的方法主要是針對外泌體內生物活性物質的研究，一旦將其應用于臨床治療，尋找有效提高外泌體純度和產量的方法亟待解決。圖1、表2匯總了目前常用分離方法的工作原理和優(yōu)缺點。

除了上述方法外，還有一些學者嘗試用離子體共振生物傳感器、納米脂質探針系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、基于膽固醇含量的熱輔助聲流體分離囊泡的技術、旋轉超濾技術、免疫修飾的超順磁性納米顆粒等技術，為快速、高效和高純度的EV分離和洗脫提供新的途徑，進而有益于外泌體的應用[6]。

EV的穩(wěn)定性較好，易于保存。常用的保存方法是將其重懸于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中，凍存在-80℃的條件下，可保存1年，且不改變其形態(tài)和生物學特性。-20℃條件凍存可穩(wěn)定保存6個月[7]。最新研究表明，低pH的酸性環(huán)境有利于EV的穩(wěn)定保存，并且能夠提高EV的產量[8]。

三、鑒定方法

目前對EV（主要是外泌體）的鑒定方法包括形態(tài)學、粒子大小、表面標志物等方面，分述如下：

1.基于抗體的鑒定方法

鑒于EV是在細胞膜通路中產生的，因此與此通路相關的抗體靶向標記可以對其進行鑒定。其中包括四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63和CD81）、AIP1/Alix、TSG101和CD326/EPCAM[9]。蛋白鑒定的方法可使用蛋白免疫印跡法。這一方法可與以下所述的一些技術結合使用，以確定EV的種群。

2. 透射電鏡

透射電鏡可用于觀察EV的表面特征。將純化的EV置于懸浮液中，放在顯微鏡樣品格上，用醋酸鈾和纖維素進行陰性染色后，透射電鏡可清晰地顯示EV的形態(tài)。鏡下觀察，EV呈現(xiàn)雙層膜包裹的囊泡結構，常被描述為“杯子形狀”，然而這也可能是處理樣品時因烘干造成的假象。因此，這一方法不應作為EV的一個明確特征，也不能用于EV來源的鑒定。

在電鏡檢查準備中，相較單一的陰性染色，還可對上述抗原進行單一或雙重染色，然后使用具有抗體特異性的不同大小的金納米粒子（例如一個抗體6 nm，另一種10 nm）來進行二次染色。在電子顯微圖像中，這些納米粒子可以清楚地區(qū)分不同大小的EV[10]。此外，還可用標準的組織電子顯微技術進行鑒定，通過抗體和組織切片的結合，得到更準確的EV存在的評估方法[11]。

3. 根據(jù)粒子大小的鑒定方法

根據(jù)粒子大小對EV進行鑒定最常用方法之一是NanoSight納米粒子跟蹤分析技術（NTA）。這一技術是在光學顯微鏡上安裝了高清攝像機，利用光散射和布朗運動的性質，通過斯托克斯-愛因斯坦方程（納米顆粒在其懸濁液中單位時間內的移動速度與其本身的粒度、溶液的粘度和溫度存在數(shù)量上的關系），對50 ～ 1000 nm直徑范圍內特定的外泌體和微囊泡進行逐個直接成像和觀察，得到與之相關的高分辨率的粒度分布數(shù)據(jù)和濃度信息，可用于外泌體的半定量檢測。與透射電鏡不同，不需要干燥、固定以及冷凍等檢測前處理，NTA可實現(xiàn)原位、更接近其原始狀態(tài)下測試，對EV顆粒可提供結構與功能上的保護，保證了測量數(shù)據(jù)的真實性和有效性。

替代NTA的還有動態(tài)光散射技術（DLS）[12]。這兩種技術都是基于粒子的布朗運動原理。然而，DLS是通過測量樣本的激光散射來計算粒子的速度，而不是測量粒子在給定時間的運動距離。另外，IZON qNano能根據(jù)可調諧電阻脈沖傳感技術測量粒子的大小和濃度[13]。

上述方法需要的樣本量非常小，而且具有可靠、半定量、快速和易用等優(yōu)點。值得注意的是，這些方法不能確定EV的來源，而且可能包括膜和其他細胞的碎片，或脂蛋白復合物。因此，這些技術應與其他更多的“定性”技術相結合，特別是電鏡，來對EV進行鑒定。

4. 流式細胞儀

EV由于顆粒太小，低于常規(guī)流式細胞儀分析的閾值，因此不能準確區(qū)分粒子與噪聲。外泌體熒光標記后可以被流式細胞儀識別，但由于“蜂擁效應”儀器本身無法準確地將粒子與噪音分開，故而粒子的多少不能被量化[14]。替代的方法是使用乳膠微球直接或以EV特異性抗體間接來綁定EV，這種抗體結合的乳膠微球可自行制作或商業(yè)化購買。然后，被綁定的EV還可以用其他熒光結合的特異性抗體進行標記。由于不清楚每個乳膠微球上綁定了多少粒子，因此粒子的數(shù)量仍不能直接獲得，但這種方法用于分析EV的表面抗原[15]。

5. 熒光和共聚焦顯微技術

EV可以用親脂性膜結合染料（如PKH67、DiD等）進行標記，也可利用其表面的巰基對EV進行標記[16-18]。此技術不能真正對每個EV進行可視化，但可用于標記的EV能否被細胞攝取的研究。

6. 其他方法

其他檢測單個EV的方法有原子力顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡、拉曼光譜分析、微核核磁共振、小角度X射線散射、反常SAXS和電阻脈沖傳感等[19]。

上述鑒定方法可結合使用，根據(jù)國際EV協(xié)會于2014年發(fā)表的一個指導手冊，建議鑒定外泌體首先需要通過蛋白免疫印跡法來鑒定EV的標志蛋白是否存在于樣品中，然后通過電子顯微鏡來觀察樣品中EV的形態(tài)特征，通過NTA等手段來分析樣品中EV的群體特征（粒子濃度、直徑分布等）。其他方法可根據(jù)研究需要決定是否應用。

綜上所述，EV作為廣泛存在的、參與細胞間信息傳遞的生物活性物質，在生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。作為近年來研究的新興領域，EV的分類、產生機制、特征也逐漸被認識，然而，由于EV體積小、密度低，其分離、鑒定難度大，是制約研究和轉化的重要因素。結合不同機理的分離和鑒定方法，以及開發(fā)更為高效、便捷的技術，是解決EV研究的重要途徑。

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（收稿日期：2019-05-18）

（本文編輯：楊江瑜）