N，N-二甲基甲酰胺通過激活Nrf2信號通路減輕順鉑引起急性臟損傷的研究

文麗波

【摘? 要】N，N-二甲基甲酰胺（DMF）具有抗炎和抗氧化的能力。我們旨在探討DMF是否可以通過NF-E2相關因子2（Nrf2）途徑調節順鉑誘導的大鼠腎臟損傷。

【關鍵詞】N，N-二甲基甲酰胺;Nrf2信號通路;急性腎損傷

【中圖分類號】R459.7?? ???【文獻標識碼】A?? ???【文章編號】1004-7484（2020）09-0096-01

順鉑是廣泛的高效抗腫瘤藥物。但是，順鉑的腎毒性也會在治療過程中引起急性腎損傷（AKI）。因此，減輕順鉑引起的腎毒性的研究已得到充分研究^【1】。近年來，NF-E2相關因子2（Nrf2）在調節氧化應激中的作用引起了廣泛關注。Nrf2是細胞防御氧化應激的重要核轉錄因子。已經證實，Nrf215-18可調節200多種內源保護性基因。

N，N-二甲基甲酰胺對由毒物和缺血引起的器官損傷的發生和發展的影響已得到公認。

動物

將共30只體重180-220g的SD大鼠飼養在溫度可控制的房間中，該房間可自由獲取食物和水。對照組大鼠灌胃蒸餾水（0.01mL/g）10天。DDP組的大鼠用蒸餾水（0.01mL/g）注射7天，然后在第7天注射順鉑（25mg/kg）。之后，將大鼠繼續用蒸餾水再給藥3天。DMF組的大鼠在頭7天用等劑量蒸餾水處理。

順鉑治療后，再給予DMF 3天。最后一次給藥后一小時，從眼眶靜脈取血，麻醉后處死大鼠。觀察并記錄在整個給藥期間大鼠的體重和日常活動的變化。

腎功能評估

每次在胃內給藥之前記錄大鼠的體重。處死大鼠后，立即收獲新鮮的雙側腎臟組織并稱重。腎臟指數=腎臟重量/體重。將總共2 mL血液樣品以3500 g/min的速度離心30分鐘。用肌氨酸氧化酶法測定血清肌酐（Cr）水平，用脲酶法測定尿素氮（BUN）水平。

組織學檢查

將每組的腎組織切成冠狀切片，用10%甲醛固定并包埋石蠟。然后將組織用蘇木精和曙紅染色。通過半定量檢查腎小管壞死評估組織學變化。評估標準如下：0=無損壞，1=10%，2=11%至25%，3=26%至45%，4=46%至75%，5=>76%。觀察到每個樣品的五個隨機選擇的區域。

TUNEL分析

根據原位DNA末端轉移酶（TUNEL）測定法（ApopTag加過氧化物酶原位細胞凋亡檢測試劑盒;Chemicon，Millipore，Billerica，MA，USA）檢測腎臟切片中的細胞凋亡。5微米厚的石蠟切片用于TUNEL染色，并用甲基綠復染。在高倍顯微鏡下計數10個隨機視野中TUNEL陽性細胞的數量。

生化測量

在腎臟組織的顏色從紅色變為白色后，將腎臟迅速移出并置于液氮中。將部分組織攪勻并儲存在-80°C的冰箱中。根據相應檢測試劑盒的說明書測量MDA，T-AOC，CAT，GSH，SOD和ROS的含量。

免疫組織化學染色

將石蠟包埋的組織脫蠟并水合后，添加50μL抗大鼠PCNA（1：100）并在室溫下孵育1小時。用PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗滌3次后，加入40-50μL相應的二抗并在室溫下再孵育1小時。加入二氨基聯苯胺（DAB）（R&D Systems，明尼蘇達州明尼阿波利斯，美國），使顏色顯影5-10分鐘。用去離子水沖洗殘留的DAB。最后將組織脫水，密封并在顯微鏡下觀察。

蛋白質印跡

向腎臟組織中添加裂解緩沖液，并在冰上振搖30分鐘。在4℃下以14，000g/min離心15分鐘后，分離總蛋白。通過二辛可寧酸（BCA）蛋白質測定試劑盒（Pierce，Rockford，IL，USA）計算蛋白質濃度。提取的蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠中分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國馬薩諸塞州Billerica的Millipore）。根據標準程序進行蛋白質印跡分析。一抗是Nrf2，血紅素加氧酶-1（HO-1），NAD（P）H，奎寧氧化還原酶1（NQO-1）。二抗是抗小鼠和抗兔抗體。

統計分析

t檢驗用于比較連續變量。分類變量使用x2檢驗或Fisher精確概率方法進行分析。進行Kaplan-Meier法評估患者的生存時間，采用Log-rank檢驗比較不同曲線之間的差異。SPSS 22.0（統計產品和服務解決方案）用于數據分析（IBM，Armonk，NY，美國）。數據表示為平均值±標準偏差（x[–]±s）。p<0.05被認為具有統計學意義。

結果

DMF預處理改善了順鉑誘導的腎損傷小鼠的腎功能。

DDP組的體重和腎臟指數顯著低于對照組（p<0.05），表明成功建立了順鉑誘導的大鼠腎臟損傷模型。與DDP組相比，用20 mg/kg DMF治療后大鼠體重和腎臟指數顯著改善（p<0.05）。此外，腎臟功能相關指標的定量分析顯示，DDP組和DMF組的血清Cr和BUN含量高于對照組（p<0.05）。然而，DMF組的BUN和Cr水平仍顯著高于對照組。

DMF保留腎臟組織學結構并減輕中性粒細胞浸潤

對照組腎臟組織顯微結構正常。DDP組觀察到管狀小管腔增大和扁平上皮。此外DDP組的腎臟組織中出現了顆粒變性和核固縮癥的紊亂細胞。DDP組也有明顯的腎小球收縮，間質增生和炎性細胞浸潤。DMF組的腎臟損傷小于DDP組。DDP組和DMF組的腎小管損傷評分均高于對照組（p<0.05）。

DMF減少順鉑誘導的腎損傷后腎小管細胞凋亡和增強的細胞殖。

DDP組腎臟的TUNEL陽性細胞數量高于假手術組（p<0.05，）。但是，與DDP組相比，DMF組腎臟的TUNEL陽性細胞明顯減少（p<0.05）。此外，我們對腎臟切片進行了PCNA免疫染色，以評估DMF是否會影響腎小管上皮細胞的增殖。DMF組的PCNA陽性細胞數量顯著高于DDP組（p<0.05）。

DMF通過增強抗氧化能力降低了ROS的產生和組織損傷

我們的數據表明，DDP可以顯著損害腎臟組織的抗氧化能力并刺激ROS的產生。施用DMF可有效恢復腎臟損傷組織勻漿（包括SOD，GSH，SOD，CAT和T-AOC）中抗氧化劑標記物的水平。DMF還減少了腎臟組織中的ROS生成。此外，DMF組腎臟組織中脂質過氧化指數MDA也顯著低于DDP組。

為了探索DMF在順鉑引起的腎臟損傷中的保護機制，我們進一步從腎臟組織中提取了總蛋白。與對照組和DDP組相比，DMF組的Nrf2表達顯著增加。

蛋白印跡結果還表明，與對照組和DDP組相比，DMF組中Nrf2的核轉錄顯著增強。Nrf2核轉錄增強也增加了DMF組中HO-1和NQO-1的水平。

參考文獻

[1]Manohar S，Leung N.Cisplatin nephrotoxicity：a re-view of the literature.J Nephrol 2018;31：15-25.

依托課題：

齊齊哈爾市科學技術局指令項目（SFGG-201902）

齊齊哈爾市科學技術局指令項目（SFGG-201410）