苯胺降解菌的分離及其降解特性

王浩權 朱興華 胡惠允 孟祥敏 崔岱宗

摘要：從吉林省吉林市某化工廠附近的土壤中分離到1株可在好氧條件下高效降解苯胺的菌株。經16S rDNA序列比對分析后發現，該菌株與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有較近的親緣關系，基于此，將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5，該菌株可在溫度為20～40 ℃、pH值為6～9及鹽度為1%～3%的條件下對苯胺進行有效降解;菌株D5可對高濃度苯胺進行降解，可在52 h內降解90%以上1 000 mg/L的苯胺;此外，菌株D5可對反復添加的苯胺連續降解，以上的特性為其日后應用于苯胺廢水的工業化處理創造了良好的條件。

關鍵詞：苯胺;假單胞菌屬;降解特性

中圖分類號： X172

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0287-04

苯胺（Aniline）是工業生產應用的一種重要化工原料，是農藥、染料、塑料及藥物生產中的重要原料及中間體，廣泛存在于印染、制藥、橡膠及其他諸多化工行業的生產廢水中[1]。近年來，越來越多的苯胺廢水被排放到自然水體和土壤中。苯胺毒性大且在自然環境中化學結構穩定，很難降解。苯胺具有嚴重的致癌、致畸、致突變的“三致”作用，并可以造成人或動物心血管系統、中樞神經系統以及其他臟器的損害，嚴重危害接觸者的健康[2-3]。基于此，美國國家環境保護局（Environmental Protection Agency，簡稱EPA）已將苯胺列為優先控制的污染物，我國及其他各國也將其列為嚴重污染環境和危害人體健康的污染物[4]。

在自然環境下，苯胺主要是在各類微生物尤其是好氧細菌的作用下進行生物降解，其降解速率受微生物活性、環境條件（如溶氧量、溫度、pH值）等因素的顯著影響[5]。近年來，國內外學者已經對苯胺的微生物降解開展了大量的研究工作，越來越多的苯胺降解細菌得到分離和純化，主要為不動桿菌屬 （Acinectobacter）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、紅球菌屬 （Rhodococcus）、戴爾福特菌屬 （Delftia）細菌[6-8]。此外，許多學者對苯胺降解相關酶基因的克隆表達及序列分析、苯胺降解的代謝途徑等進行了研究[9-12]。

雖然對苯胺生物降解的研究已取得了一定進展，但菌體對苯胺降解速度較慢、污染物耐受條件較差等缺點仍然極大地制約了降解菌株的工業化應用。因此，篩選苯胺降解能力更高、抗逆性更強的降解菌株仍然是目前研究工作的重點。

在本研究中，筆者從長期受苯胺廢水污染的環境中分離出1株可在好氧條件下高效降解苯胺的細菌，并探討不同理化因素對菌株降解苯胺的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中用于篩選苯胺降解細菌的環境樣品取自吉林省吉林市某染料生產廠附近的土壤。

富集培養基（LB液體培養基）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，加水至1 L，調pH值至7.0。

苯胺降解培養基：葡萄糖2 g、NH4Cl 1 g、Na2HPO4 2 g、NaH2PO4 1 g、MgSO4 0.2 g，加水至1 L，調pH值至7.0。進行降解試驗時添加一定濃度的苯胺。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯胺降解菌株的篩選 稱取1 g環境樣品，放入裝有50 mL滅菌水的100 mL三角瓶中，將三角瓶置于搖床上在 100 r/min 下振蕩1 h，將振蕩后的懸濁液靜置，上清液即為供接種的樣品。

取1 mL樣品加入裝有50 mL LB液體培養基的100 mL三角瓶中，于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養12 h。采用相同方法接種1代培養菌液1 mL至新鮮的LB液體培養基中進行富集培養，使樣品中的好氧菌群得到活化。

向降解培養基中加入苯胺，使培養基中苯胺的終濃度達到200 mg/L，按2%（V/V）接種量接種第2次活化的混合菌液至苯胺降解培養基中進行培養。采用此方法對混合菌液進行連續篩選培養，觀察苯胺的降解效果，初步確定混合菌液中是否存在能夠高效降解苯胺的菌株。

將篩選后的混合菌群在固體苯胺降解培養基（苯胺濃度200 mg/L）上進行劃線分離，并對長出的單菌落重新進行劃線培養。

將篩選出的菌株轉接種于LB液體培養基中，并向其中加入20%甘油作為保護劑，于-40 ℃冰箱中保藏。

1.2.2 苯胺濃度的測定 對苯胺濃度的測定采用萘乙二胺偶氮光度法[13]。

1.2.3 降解菌株的鑒定 采用16S rDNA序列分析方法對分離出的苯胺降解細菌進行鑒定。菌株基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[14]進行提取。以提取的菌株DNA為模板，采用細菌通用引物27F：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′對細菌的16S rDNA序列進行擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸 2 min，30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將經純化后的PCR產物連接至pMD 18-T質粒上，并轉化至大腸桿菌JM109感受態中，取50 μL轉化菌液涂布于LB固體培養基上，在37 ℃下培養16 h，挑取陽性克隆子進行序列測定。測序結果經軟件拼接及人工校對后，通過BLAST程序與GenBank 中的核酸數據庫進行比對并下載相關序列，采用ClustalX 1.81軟件進行多序列比對，Phylip 3.67軟件對序列進行親緣性及系統發育分析。

1.2.4 菌體生長曲線及苯胺降解曲線的測定 將菌種按2%（V/V）接種量接種到含有200 mg/L苯胺的苯胺降解培養基中，于37 ℃、120 r/min培養箱內培養，每3 h取樣1次測菌體在600 nm處的吸光值（以液體篩選培養基為空白對照）。

取2 mL菌液在8 000 r/min下離心10 min后測定上清液中的苯胺殘余含量，并計算苯胺的降解率。

1.3 不同理化因素對菌株降解苯胺的影響

1.3.1 溫度對菌體生長及苯胺降解的影響 將經活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養基（含有 200 mg/L 苯胺）中，分別置于15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的環境下培養16 h后，取3 mL菌液測定菌株生長量（D600 nm） 及苯胺的降解率。

1.3.2 pH值對菌體生長及苯胺降解的影響 將經活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養基（含有 200 mg/L 苯胺）中，培養基的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，于35 ℃好氧條件下培養12 h后，取3 mL菌液測定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.3.3 鹽度對菌體生長及苯胺降解的影響 向降解培養基中添加NaCl，使其終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，將經活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養基（含有200 mg/L苯胺）中，于35 ℃好氧條件下培養12 h后，取3 mL菌液測定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.4 苯胺濃度對降解率的影響

在無機鹽降解培養基中分別加入不同濃度的苯胺（400、600、800、1 000 mg/L），將經活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至上述含有不同濃度苯胺的培養基中，于35 ℃好氧條件下培養，記錄不同濃度苯胺的降解時間及降解率。

1.5 連續投加苯胺對降解率的影響

將經活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至含有 200 mg/L 苯胺的培養基中，于35 ℃好氧條件下培養，待培養基中的苯胺降解完全后，再向培養基中投加苯胺，使培養基中苯胺濃度重新達到200 mg/L，當第2次投加的苯胺降解后，繼續向培養基中投加苯胺。重復以上步驟，測定每次投加苯胺的降解率及降解時間。

2 結果與分析

2.1 苯胺高效降解菌株的分離與鑒定

環境樣品經過富集后，在含有苯胺的降解培養基中進行篩選，經反復平板劃線純化，得到1株苯胺降解細菌，命名為D5。對菌株D5的16S rDNA序列進行擴增測序后，結合美國國立生物技術信息中心（NCBI）數據庫中的序列信息對該菌株進行分子生物學鑒定。測序結果表明，PCR產物的長度為1 500 bp。將序列進行Blast比對后，下載相關序列，進行系統發育分析，基于各菌株的16S rDNA序列利用最大簡約法構建系統發育樹，選取枯草芽孢桿菌為外群，大于50%的自展值標記于各分枝上，結果如圖1所示。本研究篩選出的苯胺降解菌株與假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 聚為一枝，且與黃單胞菌屬 （Xanthomonas） 菌株親緣關系較近。基于此，筆者認為本研究所分離到的降解菌株屬于銅綠假單胞菌，將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5。

2.2 菌株的生長曲線及苯胺的降解曲線

將菌株D5以2%（V/V）接種量接入含有200 mg/L苯胺的無機鹽降解培養基中，測定菌體濃度和菌液中苯胺的殘留量，從而檢測菌株D5在培養基中的生長情況和對苯胺的降解情況。試驗結果（圖2）表明，菌株D5可在降解培養基中快速生長。在前3 h對培養環境適應后，菌株D5在培養基中呈現對數生長趨勢，16 h后菌體的D600 nm值可達到約1.65，由此可見200 mg/L苯胺對菌株D5的生長沒有明顯的抑制作用。在菌株生長的同時，培養體系中的苯胺濃度迅速下降，15 h內苯胺的降解率即達到90%以上，至18 h培養基中的苯胺已被完全降解。表明菌株D5是1株可在好氧條件下對苯胺進行有效降解的菌株。

2.3 溫度對菌體生長及苯胺降解的影響

本研究采用菌液濁度（D600 nm）來間接反映菌株的生長速率。從圖3可以看出，菌株D5在35 ℃下的生長速率及對苯胺的降解速率均達到最大值。在此溫度下，菌株對200 mg/L

苯胺的16 h降解率達到99%。當溫度在20～40 ℃之間時，菌株D5均保持著對苯胺較高的降解能力。如在40 ℃下，菌株經16 h的培養后仍可降解約70%的苯胺;然而，當溫度為50 ℃時，菌株的生長速率急劇下降，苯胺的降解率也明顯降低。

溫度過高或過低均會降低菌株的生長速率并抑制細菌內相關酶的活性，從而造成苯胺降解速率的下降。值得注意地是，菌株D5在低溫下具有一定的苯胺降解能力，當溫度僅為15 ℃時，菌株D5仍可在16 h內降解約32%的苯胺。東北三省冬季較寒冷，污水管道內的水溫只有10～15 ℃，低溫嚴重影響了活性污泥或降解菌株對污染物的降解速率。因此，篩選出在低溫條件下仍可降解苯胺的菌株具有較為重要的現實意義。

2.4 pH值對菌體生長及苯胺降解的影響

從圖4可以看出，菌株對苯胺降解的最適pH值為7.0，在該pH值條件下，菌株可以在16 h內降解約99%的苯胺。當降解培養基的pH值維持在6～9范圍內時，pH值的變化并未對細菌的生長和苯胺的降解造成明顯影響，在該pH值范圍內，經過16 h的培養，菌株D5可對苯胺維持85%以上的降解率。菌株D5有一定的耐堿性，在降解體系pH值為10時，菌株仍可在16 h內降解約70%的苯胺。

與溫度變化對細菌降解能力的影響相似，pH值過高或過低均會對苯胺的降解產生負面影響，其原因是過堿和過酸條件可能會影響菌體的生長和與苯胺降解有關酶的活性。

2.5 鹽度對菌體生長及苯胺降解的影響

從圖5可以看出，當降解體系中的鹽度逐漸增大時，菌株D5的生長速率逐漸減小;與之相對應，苯胺的降解速率也逐漸減小。然而， 菌株D5仍具備一定的耐鹽性，當降解體系中

的鹽濃度為1%～3%時，菌株在16 h內可對苯胺維持80%以上的降解率，即使當降解體系內的鹽度達到5%時，菌株仍可在16 h內降解約32%的苯胺。

2.6 苯胺濃度對降解率的影響

從表1可以看出，菌株D5可有效降解不同濃度的苯胺。當苯胺的濃度為400、600、800、1 000 mg/L時，菌株D5可分別在24、30、40、52 h內達到90%以上的苯胺降解率。表明菌株D5可在較高濃度的苯胺環境中生長并高效降解苯胺，說明菌株D5對高濃度的苯胺廢水具有極大的降解潛力。

2.7 連續投加苯胺對降解率的影響

從圖6可以看出，菌株D5可在16 h內對降解體系中第1次添加的苯胺基本完全降解（降解率大于98%）。在第2與第3次添加苯胺后，菌株D5均可在16 h內降解90%以上的苯胺。在第4次添加苯胺后，菌株對苯胺的降解速率稍有變慢，培養16 h后約有80%的苯胺被降解。表明菌株D5有能力對連續添加的苯胺進行降解。

苯胺降解變緩可能是由于降解體系中營養成分逐漸耗盡，剩余營養成分已經不能滿足菌體的生長和代謝。另外，降解體系中的pH值、溶氧量等理化因素也越來越不適合菌體的生長。

3 結論與討論

本研究在化工廠附近的土壤中分離到1株可以在好氧條件下對苯胺進行降解的菌株D5。經分子生物學鑒定后發現，該菌株與銅綠假單胞菌有較近的親緣關系。之前已經有報道證明，假單胞菌屬細菌可在好氧條件下高效地降解苯胺類化合物，如Oliver等從活性污泥中分離到的假單胞菌屬細菌可以降解濃度為100 mg/L以下的二苯胺[15];Bengtson等在工業廢水中篩選出的假單胞菌屬細菌可有效降解低濃度的氯代苯胺，然而，當降解底物濃度過大時，菌株的生長受到明顯抑制[16]。假單胞菌屬經菌細胞內含有苯胺雙加氧酶（aniline dioxygenase），可將苯胺氧化為鄰苯二酚，鄰苯二酚通過鄰苯二酚2，3-雙加氧酶 （catechol-2，3-dioxygenase） 繼續氧化，最后生成丙酮酸和乙醛，進入三羧酸循環，徹底得到礦化。假單胞菌屬細菌是環境中常見的革蘭氏陰性細菌，是很多污染物的分解菌株且大部分種屬對人類危害較小，因此，有較高的潛力應用于苯胺廢水的工業化處理中。

本研究篩選出的菌株可在好氧條件下高效降解苯胺。理化因素對菌株的影響顯示，該菌株可在溫度為20～40 ℃、pH值為6～9及鹽度為1%～3%的條件下對苯胺進行有效降解。低濃度的鹽離子是微生物生長所必需的，鹽離子可調節細胞滲透壓，維持膜平衡，且對部分酶促反應有促進作用。然而，當鹽離子濃度過高時，會對微生物的正常生長產生危害。因此，大多數細菌生活在鹽濃度小于1%的環境中。然而，工業苯胺廢水中往往含有較高濃度的鹽離子。因此，篩選能在較高鹽濃度下高效處理苯胺廢水的菌株具有重要意義。在本研究中，菌株D5可以在高鹽度條件下對苯胺進行降解，這為該菌株今后應用于高鹽度苯胺廢水的工業化處理提供了條件。該菌株對較高濃度的苯胺具有良好的降解效率，并可以進行苯胺的連續降解。以上的特性為其日后應用于苯胺廢水的工業化處理創造了良好的條件。

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