葡萄生單軸霉菌對葡萄幾種防御酶活性的影響

杜蕙 王春明 郭建國 漆永紅 蔣晶晶

摘要：以不同抗感霜霉病的葡萄品種高妻、夏黑、紅地球及瑞比爾為材料，通過室內人工接種方法研究葡萄生單軸霉菌侵染后不同葡萄品種過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及過氧化氫酶（CAT）活性的變化。結果表明，受葡萄生單軸霉菌侵染后不同抗性品種POD、PPO、PAL和CAT活性與對照相比均明顯提高，抗病品種酶活性較感病和高感品種上升快且維持較高活性水平，抗性品種酶活性均出現2個高峰，第1個酶活性高峰較感病品種出現得早;抗病品種CAT和PAL活性較感病品種上升幅度更大，維持時間更長。

關鍵詞：葡萄生單軸霉菌;過氧化物酶;多酚氧化酶;苯丙氨酸解氨酶;過氧化氫酶;葡萄霜霉病抗性機制

中圖分類號：S436.631

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0151-03

植物的抗病反應是寄主-病原物相互作用過程中所產生的一系列生理生化效應，保護反應是復雜的新陳代謝的結果，植物對病原物侵入的生理反應是通過酶的催化活動實現的。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及過氧化氫酶（CAT）是植物體內重要的保護酶和防御酶。大量研究表明，這些酶在寄主與病原物互作中與植物的抗病性有著重要的關系[1-3]。

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）引起的葡萄生產上最重要的病害之一，世界各地葡萄產區均有發生，是一種世界性病害[4-5]。據調查，2010年我國葡萄栽培面積達55.2萬hm2，嚴重發病地塊的葡萄霜霉病發生率高達70%以上。1834年在美國東北部的野葡萄上首次發現了葡萄霜霉病[6-7]。我國1899年發現該病危害[8]，目前幾乎所有的葡萄產區都有發生，潮濕多雨地區危害更為嚴重，發病時嚴重影響樹勢和果實品質[9]。關于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品種抗病性鑒定、病菌致病性分化及抗藥性等方面[10-14]，而與抗性有關的防御酶活性研究較少。因此，本研究以生產中主栽的鮮食葡萄品種為材料，研究不同抗性葡萄品種感染葡萄生單軸霉菌后POD、PPO、PAL及CAT活性的變化，以期豐富葡萄霜霉病抗性機制研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葡萄品種為高妻、夏黑、紅地球、瑞比爾。

供試葡萄品種于2013年秋季扦插于甘肅省農業科學院植物保護研究所溫室中。2014年8月從田間采集新鮮的葡萄霜霉病葉片，用自來水反復沖洗掉老孢子囊后，在20 ℃條件下黑暗保濕培養24～48 h，待新孢子囊長出后用毛筆刷下新鮮孢子囊，用無菌水配制成濃度為1×105～1×106個/mL孢子囊懸浮液備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 品種抗性評價 采用室內離體葉片法結合田間自然發病調查進行品種抗性評價。室內離體葉片測定時分別采集供測試葡萄品種新梢大小和葉齡基本一致的健康葉片，將事先準備好的孢子囊懸浮液用喉頭噴霧器在葉片背面均勻噴灑10 mL，然后將葉片正面朝下放在鋪有4層無菌水浸濕滅菌紗布的瓷盤中，為避免葉片與濕紗布接觸腐爛，在葉片下放置玻璃棒，葉柄用脫脂棉保濕，磁盤用保鮮膜覆蓋密封，于 20 ℃ 條件下黑暗保濕培養。以噴等量清水為對照，每個品種接種10張葉片，重復3次。逐日觀察記錄發病情況，最后用接種后7 d的調查數據計算病情指數。

田間自然發病調查參考劉天明等的方法[15]，2014年在甘肅省農業科學院林果花卉研究所葡萄園分別在霜霉病初發期（7月5日）、盛發期（8月16日）及發病后期（9月22日）共進行3次調查，每個品種選取20個新發的枝條，每個枝條自上而下調查10個葉位相同的葉片，記錄發病情況，計算平均病情指數。室內及田間病害調查分級方法按照0級：無病斑;1級：病斑面積占葉面積5%及以下;3級：病斑面積占葉面積6%～25%;5級：病斑面積占葉面積26%～50%;7級：病斑面積占葉面積51%～75%;9級：病斑面積占葉面積76%及以上進行。品種抗性評價參考劉新秀等的5級分級法[16]：免疫（I）：病情指數為0;高抗（HR）：病情指數為0.1～5.0;抗?。≧）：病情指數為5.1～25.0;感?。⊿）：病情指數為25.1～50.0;高感（HS）：病情指數為50.1～100.0。

1.2.2 酶活性測定 將配制好的孢子囊懸浮液，采用噴霧法接種于溫室盆栽葡萄苗葉片上，噴清水為對照，接種后保濕24 h。并于接種后24、48、72、96 h分別采集長勢一致、相同葉齡葡萄葉片進行酶活性測定，每個處理重復3次。所采集樣品迅速放入液氮中速凍0.5 h后，置于-40 ℃冰箱中保存備用。

POD、PPO、PAL、CAT活性測定用蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒進行，具體操作按試劑盒說明書進行。POD活性以1 g組織在反應體系中1 min使470 nm處的吸光度變化0.01，定義為1個酶活性單位;PPO活性以1 min 1 g組織在反應體系中使525 nm處的吸光度變化0.01，定義為 1個酶活性單位;PAL活性以1 g組織在反應體系中1 h使 290 nm 下吸光度變化0.1，定義為1個酶活性單位;CAT活性以 1 g 組織在反應體系中1 min使240 nm下吸光度變化01，定義為1個酶活性單位。

1.3 數據分析

試驗數據用Excel 2003進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄品種對霜霉病的抗性評價

通過室內離體接種結合田間自然發病調查，根據病情指數進行葡萄抗病性評價結果如表1所示，高妻、夏黑對霜霉病表現為抗?。≧），紅地球對霜霉病表現為感病（S），瑞必爾表現為高感（HS）。各品種在室內接種條件下病情指數均高于田間自然發病的病情指數。因為室內離體接種所提供的環境

2.2 不同葡萄品種酶活性測定結果

2.2.1 不同品種PPO活性測定結果 接種霜霉病菌后各品種PPO活性變化見圖1。與對照相比，各品種活性均有明顯提高，且不同品種之間存在差異。抗性品種接種后酶活性迅速升高，且在48、96 h出現2個酶活性高峰，活性維持時間較長;感病和高感品種接種后酶活性變化較為緩慢，且只在72 h出現了1個酶活性高峰，隨后迅速下降。整個測試期間PPO活性表現為抗性品種﹥感病品種﹥高感品種。

2.2.2 不同葡萄品種POD活性測定結果 接種霜霉病菌后各品種POD活性變化見圖2。各品種酶活性與對照相比均有明顯提高，且不同品種酶活性變化情況不同?？剐云贩N接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h出現2個酶活性高峰，活性維持時間較長;感病和高感品種接種后酶活性緩慢增加，且只在72 h出現了1個小的酶活性高峰，隨后迅速下降，高感品種下降速度更快。整個測試期間抗性品種PPO活性維持在較高的水平。

2.2.3 不同葡萄品種CAT活性測定結果 接種霜霉病菌后各品種CAT活性變化見圖3。各品種酶活性與對照相比均有明顯提高，且不同品種酶活性變化不同?？剐云贩N接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h時出現2個酶活性高峰，活性維持時間較長;感病和高感品種接種后酶活性緩慢增加，酶活性出現高峰的時間（72 h）較抗性品種晚，隨后迅速下降。 24～120 h內抗性品種較感病和高感品種CAT活性長時間維持在更高的水平。

2.2.4 不同葡萄品種PAL活性測定結果 不同品種接種霜霉病菌后PAL活性變化見圖4，各品種酶活性與對照相比均有明顯提高，且不同抗性品種酶活性變化不同。抗性品種接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h時出現2個酶活性高峰，活性維持時間較長;感病品種接種后酶活性緩慢增加，且只在72 h出現了1個酶活性高峰， 隨后迅速下降， 高感品種

下降速度更快。整個測試期間抗性品種PAL活性維持在較高的水平。

3 結論與討論

通過不同抗性水平4個葡萄品種受葡萄生單軸霉菌侵染后PPO、POD、CAT及PAL這4種酶活性的變化可以看出，不同抗性品種受葡萄生單軸霉菌侵染后POD、PPO、PAL和CAT活性與對照相比均明顯提高，抗病品種酶活性較感病和高感品種上升快且維持在較高活性水平，酶活性均出現2個高峰，第1個酶活性高峰較感病和高感品種出現得早;抗病品種CAT和PAL較感病品種活性上升幅度更大，維持時間更長，這與許多學者的研究結果[17-20]一致。

植物與病原物長期協同進化過程中，植物形成了一系列復雜的防御機制抵御病原物的入侵。植物對病原物侵入的生理反應是以酶的催化活動實現的。植物體內的POD、CAT、PPO、PAL等防御酶都與抗病性有關[21-22]。其中，POD、CAT共同組成一個防御體系，能有效清除植物體內的自由基和過氧化物[23]。PAL是莽草酸途徑的關鍵性酶，是酚代謝的主要酶之一，它的活性與酚類化合物的合成密切相關。酚的代謝產物被證實是潛在的抗病因子。酚被氧化產生活性很高的醌，而醌對病菌是有毒的。多酚的氧化與PPO和POD有關，PPO和POD活性大幅度提高可以大大增加酚氧化物的含量。另外，PPO、POD和PAL參與了木質素的合成，尤其是PPO和POD。一方面細胞壁的高度木質化對病菌的侵染和擴展有一定的限制作用。另一方面木質素對病菌是有毒的，葡萄抗霜霉病品種中PPO、POD活性增加，促進了木質素的合成，增加了其防御功能。受病原菌侵染后酶活性迅速升高且抗性品種升高的幅度大于感病品種，從而表現對病害的抗性。因此，抗性組合中寄主受病原菌侵染后迅速產生足夠量的酚類化合物及木質素，從而產生過敏性反應，殺死病菌，起到抗病的作用。感病組合不能產生足夠量的酚類化合物，因此無過敏性反應產生，不能殺死病菌。

本試驗酶活性測定結果表明，葡萄葉片受到葡萄生單軸霉菌侵染后，PPO、POD、PAL及CAT活性增加在抗性品種中均明顯高于感病和高感品種。盡管如此，也有一些觀點認為酚類物質的積累和酚氧化物活性的增加與植物抗病反應無聯系。不同的酶系在不同的寄主-病原物互作中的作用是有差異的，而且在不同的寄主與病原物組合中，同一種酶活性變化也不一致。因此，一種酶在抗病中的作用應根據具體情況具體分析，不能一概而論。

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