人參內生細菌GS-1的分離鑒定及對灰霉病菌的拮抗作用

潘曉曦 關一鳴 李美佳 張亞玉

摘要：從人參根部分離出4株內生細菌，以灰葡萄孢菌為靶向病原菌，采用平板對峙法篩選出1株拮抗細菌 GS-1，并結合形態學和分子生物學特征對其進行鑒定。結果表明，GS-1為多黏類芽孢桿菌，其活菌體能夠抑制病原菌菌絲的生長;發酵液對病原菌孢子萌發有抑制作用，抑制率達62.47%。由此判斷菌株GS-1是一株具有生防潛力的內生細菌，值得進一步開發利用。

關鍵詞：人參灰霉病;灰葡萄孢菌;內生細菌;拮抗作用;多黏類芽孢桿菌

中圖分類號： S435.675

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0148-03

灰霉病由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）引起，該病作為一種常見的真菌病害對全球幾百種作物造成嚴重損失[1]。我國于1984年首次發現灰霉病原菌能夠侵染藥用植物人參，侵染部位以根部為主。由于病原菌孢子通過空氣傳播，在適宜的環境條件下，短時間內便可造成栽培人參大面積感染病害。目前，我國人參灰霉病發生率依然偏高，已成為影響人參質量、產量的主要病害之一。農業上主要采取化學藥劑來控制人參灰霉病，但化學防治不僅會對生態環境造成污染，增加人參中農藥殘留量及病原菌的耐藥性，還會威脅施藥者的身體健康[2-4]。因此，探索新的方法來控制和解決人參灰霉病備受關注，其中微生物農藥由于其低毒性和不受病原菌抗性影響的特點，被研究并開發利用[5]。近年來，從植物內生菌中尋找生防菌資源逐漸成為研究熱點[6]。

植物內生菌生活在植物體內，它們數量眾多，種類多樣，在整個或部分生長周期中不僅不會引起宿主植物的病害癥狀，還會與宿主共同抵御外界病害的侵染，它們與病原菌競爭生長位置、營養物質和微量元素，一些內生菌可以通過產生抗生素等活性物質直接殺死病原菌或誘導植物產生激素間接提高其抗病性[7-8]。綜上所述，開發內生菌作為生防菌株發展前景廣闊，筆者從人參根部篩選拮抗內生細菌，以灰葡萄孢菌為靶向病原菌進行拮抗試驗，并通過形態學鑒定明確篩選出菌株的種屬分類地位，以期為進一步開發利用篩選出的生防菌株提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌：人參灰霉病菌（分離自人參灰霉病病株，由中國農業科學院特產研究所藥用植物研究室分離鑒定）;培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、水瓊脂（WA）培養基、NA培養基、營養肉湯培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 人參內生細菌的分離 取4年生健康園參（來源于吉林省白山市撫松縣：127°40′28″E，42°13′16″N），用清水洗凈，室溫放置干燥后，進行表面消毒，驗證表面消毒徹底后，切成1 cm左右的小段，置于WA培養基中，于25 ℃恒溫箱中培養7 d后挑取菌落并不斷劃線培養得到單一菌落[9-10]。

1.2.2 拮抗細菌的篩選 采用平板對峙法[11-12]篩選拮抗細菌：在直徑為85 mm的PDA平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，在距菌餅20 mm處點接供試內生細菌，以只接種病原菌的PDA平板作為空白對照，于25 ℃恒溫箱中培養7 d后觀察供試組是否產生抑菌圈。

1.2.3 體外拮抗效果測定 （1）檢測拮抗菌活菌體對病原菌菌絲生長的影響：采集抑菌圈邊緣病原菌菌絲及空白對照組菌絲，置于顯微鏡下觀察菌絲形態。（2）拮抗菌發酵液拮抗性能測定：用無菌水配制病原菌孢子懸浮液，濃度為1×105 CFU/mL。將拮抗內生細菌接種于營養肉湯培養基中（接種量為0.5%），于35 ℃、170 r/min下振蕩培養48 h，得發酵液原液并對其進行稀釋。將發酵液原液及50.0%、25.0%、12.5%發酵液稀釋液與等體積的灰霉病菌孢子懸浮液混合，用載玻片懸滴法[13]于25 ℃下培養，每個處理設3個重復，以加入營養肉湯培養基的病原菌孢子懸浮液為對照。當對照組孢子萌發率達90%以上時，檢查各處理孢子萌發情況，每個處理各重復隨機觀察3個視野，分別記錄孢子總數和萌發數，并計算孢子萌發率及孢子萌發相對抑制率。

萌發率=孢子萌發數孢子總數×100%;

孢子萌發相對抑制率=對照孢子萌發數-處理孢子萌發數對照孢子萌發數×100%。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定 （1）形態特征觀察：將待測內生細菌劃線接種于NA培養基上，于35 ℃恒溫培養48 h后觀察其形態特征。（2）生理生化特征測定：采用氧化酶和接觸酶試驗、厭氧生長試驗、V-P試驗、糖發酵試驗、水解淀粉、尿素試驗及耐鹽性等測定待測內生細菌的生理生化特征[14-15]。（3）基因組DNA按照生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取。以提取的DNA為模板，分別以引物7F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），引物27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）來擴增16S rDNA基因。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將所得的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的已知序列進行Blast比對分析。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離與拮抗菌株篩選

從四年生園參根部的224個樣品組織中分離出27株內生細菌，通過平板對峙試驗篩選得到1株有較強拮抗作用的內生細菌，命名為GS-1。

2.2 拮抗細菌體外拮抗效果

菌株GS-1與病原菌對峙培養7 d后，在生防菌周圍形成透明抑菌圈，抑菌圈大小不隨時間的推移而改變（圖1）。挑取2組菌絲在同倍顯微鏡下觀察可見，空白對照組病原菌菌絲生長正常;處理組抑菌圈周圍菌絲細弱、生長緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細胞壁受到破壞，原生質體外泄，表現出溶菌現象（圖2）。拮抗菌發酵液拮抗性能測定結果（表1）表明，菌株GS-1發酵液原液及50.0%發酵液稀釋液對病原菌孢子萌發抑制作用較大，抑制率分別為62.47%、56.18%，25.0%與12.5%發酵液稀釋液抑制率未達到50.00%，抑制作用較小。

2.3 菌株GS-1的鑒定

將菌株GS-1種子液稀釋后（10-7）涂布于平板上，置于35 ℃培養箱里培養48 h獲得單菌落，挑取少量菌落進行單細胞形態觀察與革蘭氏染色。觀察結果顯示，其菌落形態較小，呈不規則形邊緣開裂，表面黏稠且有光澤，顏色為乳白色;革蘭氏染色結果為陽性。依據《常見細菌系統鑒定手冊》[16]中第2部分常見細菌的鑒定方法，對菌株GS-1進行生理生化特性檢測。試驗結果（表2）表明，該菌株可厭氧生長，其接觸酶反應為陽性;氧化酶反應為陰性;硝酸鹽還原反應為陽性;V-P反應陽性;不產生吲哚，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖發酵產酸產氣;可水解淀粉，不水解尿素;不降解幾丁質但能降解果膠;溫度50 ℃時不生長;5% NaCl濃度下不生長。根據上述結果可初步鑒定菌株GS-1屬于類芽孢桿菌屬，其模式菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。測序結果顯示，菌株GS-1的16S rDNA序列大小為1 373 bp，進入GenBank進行相關序列Blast比對分析，結果顯示，該菌株與多黏類芽孢桿菌親緣性為100%。最終鑒定菌株GS-1（登錄號：MH043130）為多黏類芽孢桿菌。

3 結論與討論

目前研究已表明，某些人參內生菌對植物病原菌有抑制作用，例如李勇等從40株人參內生細菌中篩選出2株對人參菌核病菌、銹腐病菌與黑斑病菌有較強抑制作用的菌株[17]。姜云等發現一株人參內生細菌（營養型芽孢桿菌NJ13）對23種植物病原菌均具有抑制作用[18]。離體拮抗試驗在很大程度上可以預示生物防治的效果，是田間試驗的基礎。在室內利用平皿法及凹玻片法[19-20]篩選拮抗菌株是最常用且最簡便的方法，但拮抗菌株在實際應用中能否保持穩定高效還需進一步的田間試驗驗證。

植物內生菌是生物防治植物病害的天然資源，具有廣闊的應用前景，本研究從人參根部分離出的多粘類芽孢桿菌 GS-1 對人參灰霉病病原菌的菌絲生長及孢子萌發有較強抑制作用，試驗結果為灰霉病防治工作提供了新的思路，為生物農藥的研發提供了重要理論依據。

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