右美托咪定對小鼠皮膚/肌肉切口牽拉所致持續(xù)性術(shù)后疼痛的作用

楊娟 周璟 郭小文

持續(xù)性術(shù)后疼痛（persistent postsurgical pain，PPSP）是手術(shù)后并發(fā)的一類疼痛綜合征。PPSP的發(fā)生率可能比人們想象中的要高，大約為10%～50%，其中重度疼痛占2%～20%[1]。為研究PPSP的發(fā)生機(jī)制，F(xiàn)latters等[2]于2008年制作了大鼠皮膚/肌肉切口牽拉（skin/muscle incision and retraction，SMIR）模型，該模型是模擬臨床切口牽拉手術(shù)的一種新型PPSP模型。此外，臨床上PPSP大多數(shù)是持續(xù)性的、沒有外界刺激的、自發(fā)性的[3]，而傳統(tǒng)的慢性疼痛模型，多數(shù)測試機(jī)械性、冷或熱觸誘發(fā)痛，很難對動物的自發(fā)痛行為進(jìn)行測量和評價[4]。既往已有報(bào)道將條件性位置范式中的條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）用于動物模型自發(fā)痛的研究[5]。右美托味定是一種新型α2腎上腺受體（a2-adrenergic receptor，α2-AR）激動劑，是近來頗受麻醉界關(guān)注的藥物[6-7]，且有實(shí)驗(yàn)證明右美托味定可以引起實(shí)驗(yàn)大鼠的CPP[8]。本研究采用CPP研究小鼠SMIR模型的自發(fā)痛，并探討右美托咪定對SMIR小鼠觸誘發(fā)痛及自發(fā)痛的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性C57BL/6小鼠107只，6～8周齡，體重20～35g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)于溫度（25±1）℃、濕度（60±5）%、晝夜交替環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠至少提前3d適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，提前30min適應(yīng)行為學(xué)測試環(huán)境。

1.2 主要試劑和器材 0.9%氯化鈉注射液（浙江慈溪制藥廠）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海公司）；右美托味定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；von Frey纖毛刺激儀（阿根廷North Coast Medical公司）；輻射熱痛敏刺激儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（德國Sartorius公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 SMIR模型制備模擬Flatter等[2]大鼠造模方法。具體方法如下：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后置于仰臥位固定，剔除小鼠右側(cè)后肢中部手術(shù)區(qū)域鼠毛，75%乙醇反復(fù)擦拭手術(shù)區(qū)域顯現(xiàn)隱靜脈，在隱靜脈內(nèi)側(cè)3mm處作一長1.0～1.3cm的皮膚切口，暴露淺層股薄肌，鈍性分離淺層肌肉，見到白色內(nèi)收肌群肌腱筋膜，置入自制寬為1cm顯微牽開器。拉開皮膚肌肉，可見白色內(nèi)收肌群筋膜，持續(xù)牽開1h。在牽拉過程中，隱神經(jīng)被牽開器拉伸并移位，但由于其處于肌肉表層而并沒有受堅(jiān)硬物體如骨頭等壓迫。牽開期間切口用無菌生理鹽水紗布保濕，1h后縫合皮膚肌肉，注意術(shù)中保溫。假手術(shù)組（Sham組）僅分離暴露肌肉1h，不用牽開器牽拉，其余步驟相同。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)分為以下3部分：（1）將18只小鼠隨機(jī)分為SMIR組及Sham組，各9只；兩組小鼠分別于術(shù)前1d、術(shù)后第1、3、7、10、14、18d進(jìn)行機(jī)械痛閾值測試（paw withdrawal threshold，PWT）和熱縮足潛伏期測試（paw withdrawal latency，PWL）測試。（2）另選取75只小鼠隨機(jī)分為SMIR組及Sham組，術(shù)后第3天行PWT測試后，SMIR組分別腹腔注射右美托咪定 0.4μg/kg（10只）、2μg/kg（10只）、10μg/kg（9只）和 0.9%氯化鈉注射液 10ml/kg（10只）；Sham組分別腹腔注射右美托咪定0.4μg/kg（9只）、2μg/kg（9只）、10μg/kg（8只）和 0.9%氯化鈉注射液10ml/kg（10只）；兩組小鼠給藥0.5h后再次行PWT測試。（3）另選取14只小鼠隨機(jī)分為SMIR組8只及Sham組6只，術(shù)后第4天行CPP實(shí)驗(yàn)：SMIR組及Sham組腹腔注射右美托咪定10μg/kg。

1.4 行為學(xué)測試

1.4.1 PWT 將實(shí)驗(yàn)小鼠放入有機(jī)玻璃隔間（10cm×10cm×10cm），間距為1cm，置于距離桌面40cm的孔徑2mm×2mm金屬網(wǎng)格平臺上。實(shí)驗(yàn)動物在測試開始前3d適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，每天在測試環(huán)境中放置0.5h。適應(yīng)3d后用，依照Dixon等[9]報(bào)道的“up and down”法進(jìn)行，能夠使50%小鼠產(chǎn)生縮足反射的強(qiáng)度即為小鼠機(jī)械縮足反射閾值。

1.4.2 PWL 將有機(jī)玻璃箱置于3mm玻璃板上，小鼠適應(yīng)環(huán)境30min后用鹵鎢絲燈發(fā)出的熱痛刺激儀（10V，50W，光斑直徑0.8cm）照射小鼠足底。照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時為PWL值。自動切斷時間為20s，以防止組織燙傷。熱刺激強(qiáng)度在整個實(shí)驗(yàn)過程中維持一致，并保持玻璃板干燥，控制檢測室內(nèi)溫度（20±2）℃，保持環(huán)境安靜。每只小鼠測試3次，每次間隔3min，取3次平均值為大鼠PWL值，該值表示小鼠熱縮足潛伏期。

1.4.3 CPP 小鼠造模后，放置于CPP三箱中自由適應(yīng)2d，每天適應(yīng)30min。第3天對小鼠進(jìn)行15min的監(jiān)控錄像，行CPP測試：倘若每只小鼠在單側(cè)條件箱停留時間超過總時間（900s）的80%（720s）或者少于總時間的20%（180s），即視為初始有偏愛狀態(tài)而被淘汰。第4天對經(jīng)過篩選的小鼠行藥物與條件箱配對。上午小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液后，立即放入固定的一側(cè)條件箱15min。經(jīng)過4h后，小鼠腹腔注射特定藥物后立即放入固定的另一側(cè)條件箱15min。結(jié)束后立即取出放回原來鼠籠并放入鼠房。20h后再次對小鼠進(jìn)行15min的偏愛測試，統(tǒng)計(jì)小鼠在兩側(cè)條件箱中的停留時間，其差值即為偏愛指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件及繪制直方圖。計(jì)量資料以mean±SEM表示，組間比較采用two way RM ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn) 和Tukey’s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚/肌肉切口牽拉模型疼痛行為學(xué)測試

2.1.1 兩組小鼠不同時點(diǎn)PWT的比較 兩組小鼠術(shù)前1d PWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Sham組相比，SMIR組PWT術(shù)后第1天即發(fā)生顯著降低，持續(xù)降低至術(shù)后第10天，之后逐漸增高，至術(shù)后第18天幾乎恢復(fù)正常水平。Sham組大鼠同側(cè)足底術(shù)后PWT與術(shù)前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

2.1.2 兩組小鼠不同時點(diǎn)PWL的比較 兩組小鼠術(shù)前PWL比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SMIR組小鼠術(shù)后第1、3、7、10、14、18天 PWL與術(shù)前及Sham組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見表2。

2.2 右美托咪定對SMIR小鼠術(shù)后疼痛的影響

2.2.1 觸誘發(fā)痛 生理鹽水對照組中給予0.9%氯化鈉注射液前后PWT比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1a）。給予右美托咪定 0.4μg/kg、2μg/kg 0.5h后，SMIR 小鼠 PWT與給藥前相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Sham組也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1b、c）。給予 10μg/kg右美托咪定后 SMIR組PWT與給藥前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而Sham組給藥前后PWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1d）。

2.2.2 自發(fā)痛 Sham組小鼠給藥前右美托咪定配對箱和生理鹽水配對箱停留時間差值為（-35.6±58.1）s，給藥后右美托米定配對箱和0.9%氯化鈉注射液配對箱停留時間差值為（-16.7±61.5）s（圖 2a）；兩者差值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2b）。SMIR組小鼠給藥前右美托米定配對箱和0.9%氯化鈉注射液配對箱停留時間差值為（-61.5±40.6）s，給藥后右美托米定配對箱和0.9%氯化鈉注射液配對箱停留時間差值為（75.9±48.7）s（圖2c）；兩者差值相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2d）。

3 討論

研究術(shù)后疼痛的模型常用足底切口模型[10]，然而該模型形成的疼痛持續(xù)時間比較短暫，只有大約5d，而臨床上胸科手術(shù)及腹股溝疝氣手術(shù)等部分患者會出現(xiàn)長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年的慢性疼痛[11]。PPSP形成機(jī)制尚且不清，而臨床發(fā)病人群龐大，因此急需進(jìn)一步深入研究。2008年Flatters等[2]發(fā)明了大鼠SMIR模型，但基因敲除大鼠較少，難以在基因?qū)用孢M(jìn)行深入研究，因此本實(shí)驗(yàn)采用成年雄性C57BL/6小鼠，將該SMIR模型拓展到小鼠上，檢測該模型的穩(wěn)定性，同時利于后期基因水平深入地研究疾病機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Flatters等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。說明該模型作為研究PPSP具有一定的穩(wěn)定性。可以進(jìn)一步在基因水平研究PPSP的發(fā)生機(jī)制。

表1 兩組小鼠不同時點(diǎn)PWT的比較（g）

表2 兩組小鼠不同時點(diǎn)PWL的比較（s）

圖1 腹腔注射不同劑量右美托咪定前后Sham組和SMIR組小鼠PWT的變化及比較（a：生理鹽水；b：0.4μg/kg；c：2μg/kg；d：10μg/kg；與 Sham 組比較，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001）

圖2 腹腔注射0.9%氯化鈉注射液及右美托咪定前后SMIR小鼠CPP的變化及比較 （a、b：Sham組小鼠沒有出現(xiàn)CPP；c、d：SMIR組小鼠出現(xiàn) CPP；*P＜0.05）

右美托咪定作為α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)及抗焦慮等多種作用。本研究通過參考以往文獻(xiàn)[12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用0.4μg/kg、2μg/kg和10μg/kg 3個濃度梯度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)右美托咪定對SMIR術(shù)后的機(jī)械性觸誘發(fā)痛有明顯的緩解作用，且10μg/kg右美托咪定能夠誘發(fā)出位置偏愛，說明其對自發(fā)性、隨機(jī)性和持久性的自發(fā)痛也有鎮(zhèn)痛效果。本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證：右美托咪定不僅具有良好的鎮(zhèn)靜效果，還具有抑制觸誘發(fā)痛和自發(fā)痛的雙重鎮(zhèn)痛效果，是一種很有潛力的鎮(zhèn)痛藥物。

本研究結(jié)果顯示小鼠行SMIR術(shù)后與術(shù)前相比，機(jī)械痛閾明顯下降，可以持續(xù)至少14d；右美托咪定可以劑量依賴性地提高SMIR小鼠PWT值且10μg/kg右美托咪定可以改善SMIR小鼠的自發(fā)痛。筆者從行為學(xué)上研究了右美托咪定對小鼠持續(xù)性術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛作用，可能需要進(jìn)一步排除其對模型小鼠記憶力、血腦屏障等相關(guān)混雜因素的影響。PPSP的機(jī)制非常復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)并沒有對其進(jìn)行深入研究；此外，右美托咪定鎮(zhèn)痛的電生理學(xué)機(jī)制、分子生物學(xué)機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)機(jī)制并不十分清楚，均有待于我們下一步實(shí)驗(yàn)加以深入研究。